曹雪明，朱娜

(河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

冠心病(coronary heart disease，CHD)是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，近年來(lái)，CHD的發(fā)病趨勢(shì)逐年上升，且發(fā)病率趨于年輕化[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，是一種復(fù)雜的慢性炎癥性病變，病理狀態(tài)下，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙會(huì)促進(jìn)AS發(fā)展[2]。黃連素(berberine，BBR)是從黃連、黃柏等植物中提取的生物堿，具有一定的抗菌和降血脂作用，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)其可抑制平滑肌細(xì)胞增殖、改善血管內(nèi)皮功能[3]。但BBR在冠心病引起的血管內(nèi)皮損傷中的作用還未有報(bào)道，本研究通過(guò)建立冠心病大鼠模型，觀察BBR對(duì)模型動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，探討其在上述作用中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.201722172。

1.1.2 試劑

BBR(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);腦垂體后葉素(南京新百藥業(yè)有限公司)；ELISA即用型試劑盒(美國(guó)R& D system公司);RNAiso plus試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit 、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)引物(大連TaKaRa公司)。天冬氨酸水解酶 3剪切體(Cleaved-caspase 3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2 (Bcl-2) 、Bcl -2相關(guān)x蛋白(Bax)和核因子-κB抑制蛋白(IκB)、核因子-κB亞基p65抗體及羊抗兔IgG-HRP二抗(美國(guó)CST公司);GAPDH 抗體(Bioworld公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組

參考文獻(xiàn)[2]方法建立冠心病大鼠模型,每天給予高脂食物連續(xù)喂養(yǎng)6周；間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù)3次。將模型動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠30只，對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組予以高:100 mg/(kg·d)、中:50 mg/(kg·d)、低:25 mg/(kg·d)劑量BBR灌胃，每劑量組10只大鼠；對(duì)照組每天予以等BBR體積的雙蒸水灌胃。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以正常SD大鼠10只設(shè)立空白組，予以等BBR體積的雙蒸水灌胃，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療周期為12周。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法和硝酸酶還原法檢測(cè)血清中各指標(biāo)含量

參考文獻(xiàn)[4]并根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測(cè)大鼠血清中血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)含量變化。

1.2.3 RT-qPCR法檢測(cè)VEC中iNOS含量

收集各組模型大鼠的血管內(nèi)皮組織，部分用來(lái)RT-qPCR檢測(cè)。按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行RNA提取和純化，RT反應(yīng)，qPCR反應(yīng)并計(jì)算分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 免疫印跡法分析各組大鼠相對(duì)蛋白表達(dá)量

收集各組模型大鼠的血管內(nèi)皮組織，部分用來(lái)實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，及封閉。按需求加入Caspase 3抗體(1∶ 1 000)、Bcl-2抗體(1∶ 2 000)、Bax抗體(1∶ 2 000)、IκB抗體(1∶ 1 000)、p-IκB抗體(1∶ 1 000)、p65抗體(1∶ 1 000)、p-p65抗體(1∶ 500) 4℃溫育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗GAPDH(內(nèi)參,1∶ 2 000)，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，用Syngene Imaging System進(jìn)行成像，用Image J對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 、NO含量的影響

酶聯(lián)免疫吸附法和硝酸酶還原法檢測(cè)各指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，對(duì)照組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著上升，NO含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組相比，3種劑量的實(shí)驗(yàn)組中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有不同程度下降，NO上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 BBR治療前后冠心病大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 、NO含量變化

注：與空白組相比，#P<0.05；與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 BBR下調(diào)VEC中iNOS含量

RT-qPCR檢測(cè)VEC中iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，對(duì)照組iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，3種劑量的實(shí)驗(yàn)組中iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

注：*P<0.05，**P<0.01圖1 各組模型動(dòng)物iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 BBR對(duì)模型鼠VEC中 Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

蛋白印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在VEC中，與空白組相比，對(duì)照組Cleaved-caspase 3和Bax表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，3種劑量的實(shí)驗(yàn)組中Cleaved-caspase 3和Bax出現(xiàn)下調(diào)，Bcl-2顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 BBR對(duì)模型鼠VEC中 Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

表2 Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax相對(duì)蛋白表達(dá)量

注：與空白組相比，#P<0.05；與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.4 BBR下調(diào)模型鼠VEC中IκB、 p65磷酸化水平

蛋白印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VEC中，與空白組相比，對(duì)照組p-IκB和p-p65表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，3種劑量的實(shí)驗(yàn)組中p-IκB和p-p65均明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3，表3。

圖3 BBR對(duì)模型鼠VEC中IκB、 p65磷酸化水平的影響

表3 p-IκB和p-p65相對(duì)蛋白表達(dá)量

注：與空白組相比，#P<0.05；與對(duì)照組相比，*P<0.05

3 討論

CHD擁有復(fù)雜的病理機(jī)制，其中VEC損傷導(dǎo)致的功能障礙在CHD中起到了重要作用[2]。臨床研究表明，CHD患者血清NO含量明顯降低，而促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6出現(xiàn)上升[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6顯著上升，NO含量下降且通過(guò)催化精氨酸合成NO的VEC中iNOS mRNA下調(diào)，這與臨床研究相一致。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三種劑量的BBR治療模型大鼠12周后，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6均降低，血清NO及VEC中iNOS mRNA上升，提示BBR可調(diào)節(jié)大鼠模型VEC功能并減緩炎癥反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，VEC凋亡在CHD的發(fā)病過(guò)程中起到了重要作用[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型大鼠VEC中Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax表達(dá)發(fā)現(xiàn)VEC出現(xiàn)過(guò)度凋亡，而經(jīng)三種劑量的BBR治療后，上述凋亡得到明顯緩解。

細(xì)胞核因子κB(NF-κB)為廣泛存在于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分子，參與調(diào)節(jié)炎性因子和趨化因子在內(nèi)的多種生物學(xué)信號(hào)，其活性受到IκB的抑制，NF-κB在IκB發(fā)生磷酸化并被蛋白酶體降解后被激活，從而使其活性亞單位P65進(jìn)入細(xì)胞核，p65發(fā)生磷酸化進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10-11]。為探討B(tài)BR上述治療的作用機(jī)制，本研究觀察了NF-κB通路在其中的作用。結(jié)果顯示，CHD大鼠p-IκB和p-p65相對(duì)蛋白表達(dá)量明顯升高，而經(jīng)三種劑量的BBR治療后p-IκB和p-p65相對(duì)蛋白表達(dá)量下降，NF-κB活性降低。提示，冠心病大鼠VEC中NF-κB信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，而B(niǎo)BR可下調(diào)NF-κB活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB,參與調(diào)節(jié)VEC功能[12-13]，但本研究首次發(fā)現(xiàn)BBR通過(guò)NF-κB調(diào)節(jié)CHD大鼠VEC功能。目前，在BBR對(duì)CHD的作用機(jī)制方面的研究還未明了，有待于我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，BBR可能通過(guò)降低CHD大鼠VEC中NF-κB的活性，下調(diào)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，增加NO水平，從而發(fā)揮對(duì)冠心病大鼠VEC損傷的保護(hù)作用。