王豪，張久旭，李夢薇，韓星，溫浩然，冀艷華，劉洋

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

檳榔為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子。味苦、辛，性溫，具有殺蟲，行氣，利水，消積，截瘧的作用。2003年，世界衛(wèi)生組織把檳榔列入一級致癌物名錄。研究表明檳榔具有增加肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，對人和動(dòng)物具有生殖系統(tǒng)毒性[1]。并有研究認(rèn)為檳榔的毒性主要是由檳榔堿產(chǎn)生[2-3]。另有報(bào)道指出檳榔在正常劑量下使用，可能會出現(xiàn)中毒反應(yīng)，如腹痛、嘔吐、流涎、呼吸急促等癥狀[4]。檳榔中的主要化學(xué)成分為生物堿、脂肪酸和鞣質(zhì)，其中以檳榔堿含量最高。但是，檳榔水煎液中去甲檳榔次堿含量最高，這是否影響檳榔的藥效或者毒副作用，有待進(jìn)一步研究。四磨湯源于宋代醫(yī)家嚴(yán)用的《嚴(yán)氏濟(jì)生方》，全方由檳榔、烏藥、枳殼、木香組成，可順氣降逆、消積止痛，在臨床使用中具有良好的治療效果，未見有相關(guān)毒副作用的研究。

中藥配伍減毒增效的作用機(jī)制一直是中藥研究中的一個(gè)重要方向，肝臟作為機(jī)體解毒的重要器官，也常作為研究藥物毒性作用機(jī)制的器官?；跈壚茐A或檳榔水煎液的毒性和四磨湯的無毒性，本文采用體外肝微粒溫孵的方法，清晰明了的刻畫出檳榔堿在不同配伍環(huán)境下的代謝變化情況。此外，由于檳榔水煎液中去甲檳榔次堿含量最高，去甲檳榔堿和檳榔次堿含量與檳榔堿接近，并且化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此，我們懷疑檳榔水煎液的毒性是否與此有關(guān)。在研究和分析檢測中我們加入了這三種生物堿，以觀察它們的代謝行為及對檳榔堿代謝行為的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

WATERS 600液相色譜系統(tǒng)(Milford，MA，USA)，由 Delta 600四元泵和2487雙波長紫外檢測器組成，工作站為 Millennium 32；恒溫水浴鍋( HH-6，金壇市朗博儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(GL-21M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；電子分析天平(BT-25S，北京賽多利斯儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(SpectraMax L，美谷分子儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

檳榔(北京仟草中藥飲片有限公司提供，產(chǎn)地廣東)，四磨湯口服液(湖南漢森制藥股份有限公司生產(chǎn))。氫溴酸檳榔堿購于中國藥品生物制品檢定所，鹽酸檳榔次堿購于阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司，氫溴酸去甲檳榔堿購于成都思天德生物科技有限公司，鹽酸去甲檳榔次堿購于Bio-Techne中國分公司。非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、氧化型輔酶Ⅱ、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)均購于北京拜爾迪生物科技有限公司；奧美拉唑購于北京伊諾凱科技有限公司；睪酮購于北京伊諾凱科技有限公司；SD雄性大鼠肝微粒體購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥物制備

取檳榔飲片100 g，置具有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，加1 000 mL水，浸泡1 h后回流提取1 h，趁熱過濾出提取液。濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，制成含生藥約0.5 g/mL的溶液，備用。

1.4 對照品溶液配制

精密稱取氫溴酸檳榔堿7.65 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用10%甲醇水定容至刻度，得0.503 mg/mL的對照品溶液，備用。同法，分別稱取鹽酸檳榔次堿6.30 mg、氫溴酸去甲檳榔堿6.25 mg、鹽酸去甲檳榔次堿6.46 mg，得到濃度分別為0.501 mg/mL、0.500 mg/mL、0.502 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.5 溫孵體系

精密取探針混合底物50 μL(濃度分別為非那西丁200 μmol/L、氯唑沙宗400 μmol/L、甲苯磺丁脲400 μmol/L、奧美拉唑200 μmol/L、睪酮400 μmol/L)或50 μL檳榔水煎液(濃度為0.5 mg/mL)或50 μL四磨湯溶液或50 μL檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿溶液，濃度均為200 μg/L，于離心管中，氮?dú)獯蹈珊?，加?0 μL含有100 mM Tris-HCl 緩沖液，震蕩使底物溶解后，加入50 μL濃度約為2 mg/mL大鼠肝微粒體蛋白，于37℃水浴中溫孵5 min，加入100 μL NADPH 再生系統(tǒng)(含有2 mmol/L NADPNa2，20 mM G-6-P，4 U/mL G-6-PDH，20 mmol/L MgCl2)，水浴中反應(yīng)30 min，取出，立即加入200 μL冰冷的乙腈終止反應(yīng)，4℃ 15 000 g離心10 min，取上清液進(jìn)行液相分析[5]。

1.6 分析方法

色譜柱為Ultimate XB-SCX(5 μm，4.6 mm×250 mm)。柱溫箱溫度為35℃；檢測波長為215 nm，280 nm。分析時(shí)采用流速1 mL/min的梯度洗脫系統(tǒng)：A(0.2%磷酸，濃氨水調(diào)pH 3.8水溶液)-B(80%乙腈)(50∶ 50)洗脫時(shí)間為15 min。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性

在“1.6”色譜條件下測得空白孵育體系、空白孵育體系加入對照品的譜圖見圖1，在本實(shí)驗(yàn)條件下，內(nèi)標(biāo)有檳榔次堿、去甲檳榔次堿、檳榔堿和去甲檳榔堿，保留時(shí)間分別為9.416、11.603、20.275、22.604 min，結(jié)果表明該體系中內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝產(chǎn)物均不干擾待測物及內(nèi)標(biāo)的測定。

注：A.空白溫孵體系;B.空白孵育體系加入對照品圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將“1.4”中的儲備液依次稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/L濃度的溶液，進(jìn)樣分析，測定其峰面積，求得檳榔次堿、去甲檳榔次堿、檳榔堿和去甲檳榔堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=0.000 088X-10.046 821(r=0.999 1)、Y=0.000 084X-1.326 063(r=0.996 7)、Y=0.000 072X-3.614 874(r=0.999 3)、Y=0.000 096X-8.577 336(r=0.998 9)，表明四種生物堿在3.125～100 μg/L濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性。

2.1.3 回收率和精密度

分別配制檳榔堿(Arecoline)、檳榔次堿(Arecaidine)、去甲檳榔堿(Guvacoline)、去甲檳榔次堿(Guvacine)四種生物堿 100、10、4 μg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各 3 份，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。配制上述相同濃度的孵育體系溶液，按照“1.5”項(xiàng)下依法操作，不同點(diǎn)在于加入微粒體后立即加入冰冷的乙腈終止反應(yīng)，制備3份樣品，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，考察回收率。同日和連續(xù) 3 天各處理 3 份樣品，計(jì)算日內(nèi)RSD和日間RSD，結(jié)果見表1。

表1 肝微粒體酶孵育體系中檳榔四種生物堿的精密度及回收率

2.1.4 穩(wěn)定性

分別配制檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿四種生物堿100、10、4 μg/L濃度的酶孵育樣品溶液各5份，按“1.5”方法進(jìn)行樣品處理后，分別在0和4 h進(jìn)行測定，四種生物堿的RSD值均小于5%。樣品在-20℃條件下凍融3次，四種生物堿的RSD值均小于7%。

2.2 檳榔四種生物堿在肝微粒體中代謝前后的含量變化

由于檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿的結(jié)構(gòu)非常相似，并且依次去掉一個(gè)氮甲基或羧甲基，所以，我們認(rèn)為檳榔堿在代謝過程中很有可能生成另外三種生物堿，因此，在檢測指標(biāo)中加入了另外三種生物堿。比較各組代謝產(chǎn)物中檳榔生物堿的含量,按照公式1的方式進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)匯總見表2。

表2 檳榔生物堿體外溫孵實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

注：(+)表示酶有活性；(-)表示酶沒有活性

實(shí)驗(yàn)組變化率=(對照組含量-實(shí)驗(yàn)組含量)/對照組含量×100%(公式1)

通過分析各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組數(shù)據(jù)，我們可以發(fā)現(xiàn)：①當(dāng)在肝微粒體中溫孵檳榔水煎液時(shí)，除了檳榔次堿外，其他三種生物堿含量均明顯減少；②當(dāng)單獨(dú)在肝微粒體中溫孵檳榔堿時(shí)，代謝產(chǎn)物中檳榔次堿含量明顯增高；③當(dāng)在肝微粒體中溫孵四磨湯時(shí)，除了去甲檳榔次堿含量明顯增多之外，其他三種生物堿含量均明顯減少。基于這些現(xiàn)象，我們補(bǔ)充了實(shí)驗(yàn)組編號為4～7的四組實(shí)驗(yàn)，以觀察另外三種生物堿單獨(dú)使用時(shí)以及四種生物堿配合使用時(shí)在肝微粒體溫孵體系中的代謝情況。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：④當(dāng)在肝微粒體中溫孵四種檳榔生物堿時(shí)，檳榔堿和去甲檳榔堿含量減少，其中檳榔堿含量明顯減少，檳榔次堿和去甲檳榔次堿含量則明顯增多；⑤當(dāng)單獨(dú)在肝微粒體中溫孵檳榔次堿時(shí)，代謝產(chǎn)物中去甲檳榔次堿含量明顯增高；⑥當(dāng)單獨(dú)在肝微粒體中溫孵檳榔堿時(shí)，代謝產(chǎn)物中檳榔次堿含量明顯增高；⑦當(dāng)單獨(dú)在肝微粒體中溫孵去甲檳榔堿時(shí)，代謝產(chǎn)物中去甲檳榔次堿含量明顯升高。

3 結(jié)論

通過上述實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為檳榔堿能夠在肝微粒體中被代謝為無毒的檳榔次堿，從而達(dá)到減毒效果。而四磨湯中的某個(gè)或某些成分能夠促進(jìn)肝微粒體對檳榔堿的代謝，從而達(dá)到配伍減毒的效果。

4 討論

在本文研究之前我們進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)：將12只SD雄性大鼠隨機(jī)分成兩組，分別灌胃含檳榔生藥材量一樣的檳榔水提液和四磨湯，連續(xù)3 d。結(jié)果檳榔水提液組的大鼠全部死亡，而四磨湯組大鼠則正常存活，由此現(xiàn)象我們認(rèn)為檳榔水提液具有一定的毒性，而相同濃度下的四磨湯則沒有毒性。并且通過分析檳榔水提液中生物堿的含量，發(fā)現(xiàn)主要存在四種生物堿，分別為檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿和去甲檳榔堿，其中去甲檳榔次堿的含量約為檳榔堿含量的3倍。所以，我們認(rèn)為關(guān)于檳榔水煎液在臨床應(yīng)用產(chǎn)生毒副作用相關(guān)的報(bào)道案例較少的可能原因之一就在于此。同時(shí)，這說明檳榔在水煎煮提取過程中，可能是由于水對檳榔堿的提取不完全或者是檳榔堿長時(shí)間加熱遭到了破壞所致，也印證古人所說的“檳榔見火無功”的說法。此外，古人在應(yīng)用四磨湯的時(shí)候強(qiáng)調(diào)要采用“磨取汁，溫服”的方法才能起到快速發(fā)揮藥效的作用，大概的緣由之一就在于此吧。

綜上，通過我們的研究，初步認(rèn)為四磨湯中存在促進(jìn)檳榔堿代謝的成分，從而達(dá)到配伍減毒的效果。關(guān)于中藥配伍減毒作用機(jī)制更加清晰具體的研究有待進(jìn)一步開展。