楊萍，周玉平，常秀春，王鳳，李高文

(1.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護理學(xué)院，浙江 寧波 315100;2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)病因病機以心氣虛衰為本，心血瘀阻、痰濁內(nèi)生為標(biāo)，為本虛標(biāo)實證，中醫(yī)藥治療以益氣養(yǎng)心扶正以固本，活血化瘀祛痰以治標(biāo)[1]。黃芪是歷代醫(yī)家治療心血管疾病最常用的中藥。黃芪甲苷(Astragaloside-Ⅳ, AS-Ⅳ)是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，具有包括抗缺血/再灌注損傷作用在內(nèi)的多種心血管藥理作用[2]。黃芪甲苷防治心血管疾病的機制主要與抗氧化、抗炎作用有關(guān)[3-4]，但其具體的靶向分子及信號通路尚不十分明確。

血紅素氧化酶1(Heme oxygenase，HO-1)是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在各種病理性刺激時誘導(dǎo)產(chǎn)生。HO-1通過降解氧化型血紅素，產(chǎn)生具有抗氧化作用的膽紅素和具有抗炎作用的一氧化碳，因此近年來被公認為是一種重要的抗氧化劑及組織保護酶[5]。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1對具有心肌細胞損傷具有保護作用[6]。HO-1是否介導(dǎo)了黃芪甲苷對缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)損傷的心肌細胞保護作用值得研究與證實。本研究以原代心肌細胞H/R心肌損傷模擬心肌缺血再灌注損傷，探討黃芪甲苷抗H/R損傷作用機制，為闡釋中藥抗心肌缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠乳鼠，SPF 級，出生1～3 d，雌、雄不限，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2016-0011。

1.2 藥物與試劑

黃芪甲苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：170614， 純度≥99%)；原卟啉氯化鈷(Copp)、原卟啉Ⅸ鋅(Ⅱ)絡(luò)合物(Znpp)、四甲基唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國GIBCO 公司；兔抗小鼠GAPDH 多克隆抗體和兔抗小鼠HO-1 多克隆抗體購自Santa Cruz；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。RIRP裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-AGE凝膠配置試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣有限公司)；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；全自動生化分析儀(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 心肌細胞原代培養(yǎng)

參考文獻[7]方法進行心肌細胞原代培養(yǎng)：取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，無菌條件下取出心臟，胰酶消化法將心肌組織逐步分離成單個心肌細胞，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)90 min后，差速貼壁去除成纖維細胞。將純化后的心肌細胞調(diào)整濃度，接種至6孔板或96孔板中，每24 h更換1次培養(yǎng)液。72 h后心肌細胞已成片搏動，當(dāng)細胞基本融合時進行實驗。

2.2 H/R損傷模型復(fù)制

參照文獻[8]并加以改進建立心肌細胞H/R模型。將培養(yǎng)的心肌細胞以模擬缺血溶液置換正常培養(yǎng)液，置于缺氧裝置中培養(yǎng)4 h，即為缺氧模型。再換用模擬再灌注溶液，于常氧環(huán)境中培養(yǎng)4 h，即為復(fù)氧模型。

2.3 AS-Ⅳ給藥濃度確定

將心肌細胞懸液以5×104個/mL接種于96 孔板，留出1個孔不加細胞懸液，作為空白對照組。當(dāng)細胞培養(yǎng)至融合成片搏動時，加入含不同濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)液(終濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)，同時設(shè)立正常對照組(不干預(yù))、模型組(H/R)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 。MTT法測定心肌細胞活力，以測定吸光度(A)，取平均值計算

細胞活力=A藥液-A空白/A正常對照-A空白×100%

2.4 細胞分組及干預(yù)

心肌細胞懸液以5×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL。留出1個孔不加細胞懸液，作為空白對照組。將培養(yǎng)的心肌細胞隨機分為6組：①正常對照組(Normal control);②H/R組；③H/R+AS-Ⅳ組(造模后給予AS-Ⅳ100 μmol/L干預(yù)24 h)；④H/R+Copp(造模后給予終濃度為20 μmol/L Copp干預(yù)24 h)組；⑤H/R+Znpp(造模后給予終濃度為20 μmol/L Znpp干預(yù)24 h)組。⑥H/R+Znpp+AS-Ⅳ(造模后給予終濃度為20 μmol/L Znpp干預(yù)24 h，再給予AS-Ⅳ100 μmol/L干預(yù)24 h)組 。每個組設(shè)置6個復(fù)孔。

2.5 MTT測定細胞活力

按實驗分組給予相應(yīng)的處理因素后棄去上清液，每孔加入MTT溶液(終濃度為0. 5 mg/L)100 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min至藍紫色結(jié)晶甲瓚充分溶解，在波酶標(biāo)儀490 nm處檢測其吸光度A。取平均值計算細胞活力。

2.6 cTnT、SOD、GSH-PX含量的測定

取各組培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明檢測心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)含量。

2.7 hs-CRP、TNF-α含量的測定

按實驗分組給予相應(yīng)的處理因素后，取各組培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明采用ELISA法檢測細胞上清液中超敏C反應(yīng)蛋白(Hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。

2.8 Western blot測定HO-1蛋白表達

心肌細胞懸液以5×105個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL。按實驗分組給予相應(yīng)的處理因素后收集細胞，裂解細胞并提取總蛋白，根據(jù)BCA 蛋白定量法檢測各蛋白濃度。取樣品蛋白質(zhì)50 μg，與SDS上樣緩沖液混合，95～100℃變性5 min；制膠，上樣，電泳，切膠，半干轉(zhuǎn)膜器恒壓12V轉(zhuǎn)PVDF膜60 min，PBST洗膜10 min×3次,以5% BSA/PBS封閉1 h， 加入一抗中4℃輕搖孵育過夜，PBST洗膜10 min×3次, 加入二抗室溫輕搖孵育1 h，將膜置于Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)曝光，獲取目的條帶圖像。Image J軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。取3次重復(fù)實驗結(jié)果的均值進行比較。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組心肌細胞活力比較

心肌細胞經(jīng)H/R處理后，H/R組細胞活力較正常對照組顯著降低，說明H/R可造成心肌細胞損傷。隨著AS-Ⅳ藥液濃度的增加，細胞活力呈濃度依賴性增高，與H/R模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明黃芪甲苷呈濃度依賴性減輕H/R誘導(dǎo)的細胞損傷，確定AS-Ⅳ干預(yù)濃度為100 μmol/L，結(jié)果見表1。

本實驗結(jié)果顯示，與H/R組比較，HO-1誘導(dǎo)劑CoPP可顯著增加心肌細胞活力，而HO-1抑制劑ZnPP組細胞活力顯著降低，說明增加HO-1含量可減輕H/R誘導(dǎo)的細胞損傷；心肌細胞經(jīng)H/R預(yù)處理后，給予AS-Ⅳ干預(yù)24 h，細胞活力較H/R模型組顯著改善。結(jié)果見表2。

表1 不同濃度AS-Ⅳ對H/R損傷心肌細胞模型細胞活力的影響

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

表2 各組心肌細胞活力比較

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

3.2 各組心肌細胞cTnT、SOD、GSH-PX水平比較

與Normal control組比較，H/R組心肌細胞SOD、GSH-PX活性顯著降低，而cTnT活性顯著增加，ZnPP則顯著加重H/R導(dǎo)致的上述指標(biāo)變化，說明ZnPP可加重H/R導(dǎo)致的氧化平衡體系失衡；黃芪甲苷、CoPP可顯著增加H/R預(yù)處理后的SOD、GSH-PX活性，降低cTnT活性，說明黃芪甲苷、CoPP對心肌細胞的保護作用與抗氧化作用有關(guān)。結(jié)果見表3。

表3 H/R預(yù)處理后各組細胞cTnT、SOD、GSH-PX水平

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

3.3 各組細胞上清hs-CRP、TNF-α水平比較

心肌細胞經(jīng)H/R預(yù)處理后，細胞上清炎癥因子hs-CRP、TNF-α表達較正常對照組顯著增高(P均=0.000)，ZnPP則顯著加重H/R導(dǎo)致的上述指標(biāo)變化，說明ZnPP可進一步促進H/R誘導(dǎo)的炎癥因子hs-CRP、TNF-α的表達。經(jīng)黃芪甲苷、CoPP干預(yù)后，細胞上清中hs-CRP、TNF-α水平顯著降低，說明黃芪甲苷、CoPP可減輕H/R誘導(dǎo)的炎癥因子表達。結(jié)果見表4。

3.4 各組心肌細胞HO-1蛋白表達水平比較

與H/R組比較，心肌細胞經(jīng)H/R+COPP干預(yù)后HO-1蛋白表達顯著增高，經(jīng)ZnPP干預(yù)后HO-1蛋白表達顯著下降；與H/R組比較，經(jīng)AS-Ⅳ干預(yù)后，HO-1蛋白表達顯著升高，且與H/R+COPP組無顯著差異，說明AS-Ⅳ可促進心肌細胞HO-1蛋白表達。結(jié)果見圖1。

表4 H/R預(yù)處理后細胞上清hs-CRP、TNF-α表達的影響

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

圖1 各組細胞中HO-1蛋白表達的比較

4 討論

近年來，隨著對心肌缺血再灌注損傷研究的不斷深入，氧自由基損傷、炎癥介質(zhì)釋放被認為是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中的始動因素[9]。因此，維持體內(nèi)氧化平衡體系的穩(wěn)定，干預(yù)炎癥是保護心肌細胞的重要手段。越來越多的研究證實，增加HO-1基因表達可通過多種途徑發(fā)揮心血管保護作用，如抗缺血再灌注損傷，抗動脈粥樣硬化和增加斑塊的穩(wěn)定性，抑制心肌肥厚，抑制心肌細胞凋亡等[10-11]。本研究通過給予HO-1特異性激動劑鈷原卟啉或抑制劑鋅原卟啉對H/R造模后心肌細胞進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)HO-1誘導(dǎo)劑CoPP可改善心肌細胞H/R損傷所致的細胞活力下降，增強抗氧化酶活性，抑制炎癥因子表達，而HO-1抑制劑ZnPP則進一步加重H/R損傷所致的細胞損傷。說明HO-1抗心肌細胞H/R損傷與抑制炎癥因子表達，抗氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，HO-1是治療心血管疾病的一個很好的潛在靶點，通過各種方式誘導(dǎo)HO-1表達必然在缺血再灌注損傷時的細胞保護方面發(fā)揮重要作用。

根據(jù)心肌缺血再灌注損傷患者臨床特征，中醫(yī)學(xué)者認為其病機心氣虛衰為本，故其治則當(dāng)以益氣養(yǎng)心扶正以固本。動物實驗及和臨床實際觀察的基礎(chǔ)上已證明多種中藥和中藥復(fù)方有一定的保護作用，其機制多以抗氧化、抗炎為主[12]。黃芪味甘，微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有健脾補中，補氣固表、升陽舉陷、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效，成為中醫(yī)臨床常用補益中藥。黃芪甲苷是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，為黃芪制劑質(zhì)量鑒定的指標(biāo)成分，在藥典中被作為黃芪質(zhì)量檢測標(biāo)志物。實驗研究證實黃芪甲苷對多種心肌細胞損傷模型具有顯著的保護作用，具有增強心肌收縮力，改善心肌能量代謝，抑制心肌纖維化和心肌細胞凋亡作用[13-14]。本實驗結(jié)果顯示：黃芪甲苷可顯著增高HO-1蛋白表達水平；與模型組比較，黃芪甲苷干預(yù)后的心肌細胞活力呈濃度依賴性增高，顯著增加H/R預(yù)處理后的SOD、GSH-PX活性，降低cTnT活性，降低炎癥因子hs-CRP、TNF-α表達。當(dāng)H/R心肌細胞預(yù)先經(jīng)HO-1抑制劑ZnPP預(yù)處理后，再進行黃芪甲苷干預(yù)，結(jié)果顯示：與模型組比較，其細胞活力、氧化平衡體系、炎癥因子表達無顯著性差異。由此可以明確，黃芪甲苷可減輕H/R誘導(dǎo)的細胞損傷，其作用機制之一可通過誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達，通過HO-1介導(dǎo)的抗氧化、抗炎作用發(fā)揮抗心肌細胞H/R損傷作用。