張少華，王君實，董維鵬，燕 炯

(山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，山西 太原 030001)

脂滴是脂肪細胞中重要的一種細胞器，脂代謝紊亂會造成脂肪堆積，進而導致肥胖的發(fā)生[1]。圍脂滴蛋白(perilipin 1, PLIN1)作為脂滴表面蛋白重要的一員，在脂肪分解代謝起屏障保護作用[2]。目前認為，調(diào)控脂肪分解的經(jīng)典通路是環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)信號通路(簡稱cAMP/PKA通路)，激活該通路可以使PLIN1和HSL磷酸化，促進脂解的進行[3]。

蛋白激酶C(PKC)-絲裂原活化細胞外調(diào)節(jié)信號激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase, MEK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信號通路(簡稱PKC-MEK/ERK通路)也可對脂解作用進行調(diào)節(jié)，該通路激活后可磷酸化激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)，進而促進脂肪分解，而腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α以及楊梅素(myricetin, Myric)均通過該條通路引發(fā)促脂解作用[4]。

本實驗擬通過沉默PLIN1與楊梅素聯(lián)合干預的方法，觀察脂解通路相關(guān)指標的變化，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：3T3-L1前脂肪細胞系(Boster生物工程公司)。

1.1.2 試劑：Lipofectamine? LTX & Plus Reagent(Invitrogen公司)；楊梅素(上海阿拉丁試劑有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液、青鏈霉素混合液和羊抗兔二抗(Boster生物工程公司)；p-HSL、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK和p-MEK抗體(CST公司)；cAMP、PKA和p-PKC小鼠ELISA試劑盒(上海西塘科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：將3T3-L1前細胞接種于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，取處于對數(shù)增殖期的細胞接種于6孔板中。采用經(jīng)典“雞尾酒”方法對細胞進行誘導分化為成熟的脂肪細胞[5]。在細胞匯合到80%左右時，將培養(yǎng)基換成誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ，2 d之后換為誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每2 d換液1次，誘導分化為成熟脂肪細胞，成功后進行后續(xù)操作。

楊梅素聯(lián)合sh-RNA重組干擾載體進行干預實驗。隨機分為對照組、sh-RNA組、Myric組和Myric+sh-RNA組。楊梅素干預條件的篩選實驗結(jié)果顯示，楊梅素在干預濃度和干預時間分別為100 μmol/L和72 h時脂解效果最明顯。本課題組前期已構(gòu)建PLIN1的sh-RNA干擾載體，并已成功驗證其可有效促進脂肪細胞的脂解作用，根據(jù)本課題組前期優(yōu)化后的細胞轉(zhuǎn)染條件進行操作[6]。將5 μg質(zhì)粒與10 μL脂質(zhì)體混勻，轉(zhuǎn)染進脂肪細胞。轉(zhuǎn)染6 h后，Myric組和Myric+sh-RNA組換成含有Myric(100 μmol/L)的培養(yǎng)基干預72 h，其余兩組換成正常培養(yǎng)基。

1.2.2 脂滴油紅O染色：每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，室溫下靜置2 h。棄掉溶液，加入油紅O工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。1 h后，沖洗2遍，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Western blot檢測各組蛋白含量：干預結(jié)束后，每孔加入200 μL含PMSF和磷酸化蛋白酶抑制劑的細胞總蛋白裂解液，提取各組蛋白，用BCA法測定各組蛋白濃度，并調(diào)平濃度。制備凝膠，每個泳道加50 μg待測樣品，濃縮膠80 V恒壓電泳，分離膠120 V恒壓電泳后，220 mA恒定電流進行濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2 h。用封閉液稀釋的一抗進行反應，4 ℃過夜。二抗孵育時37 ℃振搖70 min。取出條帶，加入ECL發(fā)光工作液，暗盒暗室曝光。ImageJ軟件對目的蛋白條帶進行分析并測定吸光度值，以β-actin進行校正。

1.2.4 ELISA測定細胞中cAMP、PKA和p-PKC含量：嚴格按照雙抗體夾心ABC-ELISA試劑盒說明書進行操作，在450 nm波長處測定吸光度(A)值，繪制標準曲線，計算待測樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 楊梅素與sh-RNA干擾載體對脂滴形態(tài)及分布的影響

油紅O染色后，對照組脂滴顏色深，大脂滴分布最多；sh-RNA組和Myric組脂滴呈“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)圍繞細胞核，顏色變淺，脂滴變??；Myric+sh-RNA組鏡下顯示脂滴數(shù)量進一步減少，大脂滴數(shù)量明顯減少(圖1)。

2.2 楊梅素與sh-RNA干擾載體對cAMP/PKA信號通路的影響

Myric+sh-RNA組和Myric組的cAMP 和PKA含量較對照組降低(P<0.05)(表1)。Myric+sh-RNA組和Myric組的p-HSL蛋白表達量高于sh-RNA組和對照組(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with sh-RNA group圖2 各組中p-HSL蛋白的表達Fig 2 Expression of p-HSL protein in each group

groupcAMP(pmol/mg protein)PKA(ng/mg protein)control 355±14 1.533±0.088sh-RNA 389±28 1.703±0.072Myric 282±18*△ 1.010±0.019*△Myric+sh-RNA 284±60*△ 1.151±0.097*△

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sh-RNA group.

2.3 楊梅素與sh-RNA干擾載體對PKC-MEK/ERK信號通路的影響

2.3.1 楊梅素與sh-RNA干擾載體對p-PKC含量的影響：Myric+sh-RNA組和Myric組p-PKC含量較其余兩組含量升高(P<0.05)(表2)。

表2 p-PKC濃度的測定Table 2 Concentration of n=6)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sh-RNA group.

2.3.2 楊梅素與sh-RNA干擾載體對p-MEK/MEK及p-ERK/ERK比值的影響：Myric+sh-RNA組和Myric組較其他兩組的p-MEK和p-ERK蛋白表達含量升高(P<0.05)(圖3)。

3 討論

cAMP/PKA信號通路是調(diào)節(jié)脂肪分解的經(jīng)典通路。當兒茶酚胺類激素存在時，可與細胞膜上的β-腎上腺素受體相結(jié)合，刺激G蛋白與腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶，催化cAMP表達，cAMP作為第二信使可激活PKA，進而磷酸化HSL和PLIN1[7]。有報道磷酸化的HSL(p-HSL)酶活性較HSL增加約100%[8]。磷酸化的PLIN1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與CGI-58分離并移出脂滴表面，對脂滴失去屏障保護作用，更多的p-HSL移位至脂滴表面，發(fā)揮其水解作用；同時CGI-58游離于細胞質(zhì)中，與ATGL相結(jié)合并激活其脂解作用。

近年來，PKC-MEK/ERK信號通路是調(diào)控脂解的熱點研究通路。對TNF-α的研究發(fā)現(xiàn)，其對cAMP/PKA沒有影響，卻可通過激活PKC-MEK/ERK信號通路來發(fā)揮促脂解的作用[9]。當TNF-α以及楊梅素等促脂解因子存在時，可激活PKC，促使PKC磷酸化，進而激活p-MEK，p-MEK又可激活p-ERK，p-ERK進一步促使HSL的磷酸化，從而發(fā)揮促進脂肪分解[10-11]。但也有報道顯示，PKC-MEK/ERK信號通路激活后只磷酸化HSL，而對PLIN1沒有磷酸化作用[12]。

本實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合干預組和楊梅素組cAMP和PKA表達含量均明顯低于轉(zhuǎn)染組和對照組，并且sh-RNA組和對照組表達無差別。這說明PLIN1基因沉默對上游cAMP/PKA信號通路沒有影響，而楊梅素則對該通路中相關(guān)因子的活性起一定的抑制作用。聯(lián)合干預組和楊梅素組p-PKC、p-MEK、p-ERK以及p-HSL蛋白表達量均顯著高于轉(zhuǎn)染組和對照組,提示楊梅素的促脂解作用主要是通過激活PKC-MEK/ERK信號通路，增加p-HSL的表達量來實現(xiàn)的，而沉默PLIN1對該通路無影響。

本次實驗主要探討了PLIN1沉默與楊梅素作用對脂解通路上的影響，為進一步了解其生物功能及今后肥胖癥的防治提供了實驗基礎(chǔ)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with sh-RNA group圖3 各組對MEK/ERK信號通路的影響Fig 3 Effect of myricetin and PLIN1 on PKC-MEK/ERK signaling n=3)