董坤倫，陶 雷，楊 潔，尚軍潔

(南陽市第二人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河南 南陽 473000)

近年來糖尿病發(fā)病率逐漸上升且發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢，推測到2025年全世界糖尿病患者將達(dá)到3億[1]。90%的糖尿病患者是2型糖尿病。吳茱萸堿(evodiamine, Evo)具有多種藥理活性，如降血脂、降血糖、抗感染和抗腫瘤等[2]。關(guān)于Evo治療糖尿病的報(bào)道很多，但其機(jī)制研究尚缺乏。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：清潔級SD大鼠50只，雌性(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK 20150003)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：吳茱萸堿(阿拉丁試劑有限公司)；葡糖氧化酶試劑盒(西安舟鼎國化學(xué)試劑有限公司)；胰島素放免試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；NF-κB與TLR4抗體(Santa Cruz公司)；其余試劑為國產(chǎn)試劑純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠分為對照組、2型糖尿病大鼠模型組[3]和吳茱萸堿低、中及高劑量干預(yù)組，分別用吳茱萸堿10、20和40 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.2.2 生化指標(biāo)的檢測：用試劑盒每周1次檢測空腹血糖與血清胰島素水平。

1.2.3 糖耐量的測定(OGTT)：末次給藥后，各組大鼠禁食3 h，鼠尾采血測定血糖值；大鼠口服葡萄糖(2.0 g/kg)，測定30、60與120 min的血糖值，繪制糖耐量曲線，觀察吳茱萸堿對糖尿病大鼠糖耐量水平的影響。

1.2.4 HE染色觀察肝臟組織：常規(guī)切片觀察。

1.2.5 免疫印跡法：末次給藥后，分離肝臟，剪碎，冰上勻漿，加入裂解液30 min，4 ℃12 000×g離心5 min，取上清液，提取總蛋白并測定蛋白濃度，每道加入50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含10%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，再加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸堿對糖尿病大鼠血糖與血清胰島素水平的影響：與正常對照組相比，模型組大鼠的血糖水平顯著升高，血清胰島素水平顯著下降(P<0.05)，Evo干預(yù)使血糖水平明顯回落，血清胰島素水平明顯回升(表1)。

表1 吳茱萸堿對糖尿病大鼠血糖與血清 胰島素水平的影響

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with diabetes group.

2.2 吳茱萸堿對糖尿病大鼠糖耐量水平的影響：與正常對照組相比，糖耐量曲線下面積顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，Evo干預(yù)使血糖隨劑量增大而糖耐量曲線下面積逐漸減小(P<0.05)(圖1，2)。

2.3 吳茱萸堿對糖尿病大鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)的影響：模型組大鼠的肝臟組織出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤，組織間有空隙；Evo給藥4周后，大鼠肝臟組織的炎性細(xì)胞浸潤程度隨處理藥物增大而減少，組織間隙減少(圖3)。

2.4 吳茱萸堿對糖尿病大鼠肝臟中NF-κB蛋白表達(dá)的影響：與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟的NF-κB蛋白表達(dá)顯著上升；Evo干預(yù)4周后，NF-κB蛋白表達(dá)隨劑量增大而逐漸回降(圖4)。

圖1 吳茱萸堿對糖耐量曲線的影響Fig 1 Effect of Evo on the glucose tolerance curve

*P<0.05 compared with control； #P<0.05 compared with DIA圖2 吳茱萸堿對糖耐量曲線下面積的影響Fig 2 Effect on the area under the glucose tolerance

圖3 吳茱萸堿對糖尿病大鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)的影響Fig 3 Effect on the pathological morphology of liver by Evo

2.5 吳茱萸堿對糖尿病大鼠肝臟中TLR- 4蛋白表達(dá)的影響：與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟的TLR- 4蛋白表達(dá)顯著上升； Evo干預(yù)4周后，大鼠肝臟中TLR- 4蛋白表達(dá)隨劑量增大而逐漸下降(圖5)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿能夠顯著降低2型糖尿病大鼠空腹血糖值，而且能夠降低糖耐量水平，提示吳茱萸堿可能控制2型糖尿病大鼠空腹與餐后血糖水平。對大鼠胰腺的病理組織觀察，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿對糖尿病大鼠胰腺具有保護(hù)作用，抑制胰島細(xì)胞的減少，推測吳茱萸堿可能具有保護(hù)2型糖尿病大鼠胰腺的作用。

TLR4在肝損傷中具有重要的作用，啟動NF-κB信號通路，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)多種炎性反應(yīng)和細(xì)胞因子分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿能夠降低2型糖尿病大鼠肝臟中NF-κB與TLR4的蛋白表達(dá)，推測吳茱萸堿可能通過抑制NF-κB與TLR4的表達(dá)，從而抑制炎性反應(yīng)的加重，減輕肝臟損傷，同時(shí)減少胰島細(xì)胞的萎縮。

*P<0.05 compared with control； #P<0.05 compared with DIA圖4 吳茱萸堿對糖尿病大鼠肝臟中NF-κB 蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Expression of NF-κB in the liver of diabetic rats after treated by Evo(n=6)

*P<0.05 compared with control； #P<0.05 compared with DIA圖5 吳茱萸堿對糖尿病大鼠肝臟中TLR- 4 蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Expression of TLR- 4 in the liver of diabetic rats after treated by n=6)