蔡惠美，曹文瑜*，黃玉鈿，傅建英，馬燕燕

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院 1.消化內(nèi)科; 2.病理科, 福建 福州 350000)

侵襲和轉(zhuǎn)移是威脅腫瘤患者生命的主要因素，也是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征[1-3]。高遷移率蛋白B1(high-mobility group box-1 protein, HMGB1)是一種腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)蛋白，存在于多種生物體內(nèi)，在人體內(nèi)廣泛分布于淋巴組織、肝、腦、肺、心和腎等組織中，在進(jìn)化中高度保守[4]，其表達(dá)和腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[5-6]。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product, RAGE)是細(xì)胞表面分子中免疫球蛋白超家族的成員之一，RAGE參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-8]。而RAGE是HMGB1的唯一受體。關(guān)于HMGB1和RAGE蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。

本研究旨在探討肝癌組織及細(xì)胞中HMGB1及RAGE的表達(dá)，研究HMGB1抑制肝癌細(xì)胞凋亡的可能作用途徑，分析肝癌的可能致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織樣本及細(xì)胞：選擇2012 年1月至2016 年6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院消化科收治的25例原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象，25例患者中男20例，女5例，年齡38～76歲，平均(52.5±11.6)歲。瘤體≤5 cm者15例，瘤體>5 cm者10例。以距癌灶邊緣5 cm為界分別留取癌灶組織和非癌組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌。該研究已獲得單位倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)書(shū)及受試者簽署的知情同意書(shū)。HepG2細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞研究所)。

1.1.2 試劑及試劑盒：鼠單克隆抗體HMGB1(ab11354)和RAGE(ab54741)(Abcam公司)。S-P免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清、鏈霉素和青霉素、DMEM和RPMI1640高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；重組人HMGB1蛋白(Active Motif公司)；MTT試劑盒(碧云天生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法HMGB1和RAGE表達(dá)：肝癌及癌旁組織免疫組化以經(jīng)典的S-P 法進(jìn)行。HMGB1工作濃度1∶100，RAGE工作濃度1∶200，每片滴加HMGB1一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜；DAB顯色。以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照；用已證實(shí)的HMGB1染色陽(yáng)性肝癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 HepG2和L02細(xì)胞系的培養(yǎng)：HepG2和L02細(xì)胞系分別采用含有10%胎牛血清及鏈霉素(100 U/mL)、青霉素(100 U/mL)的DMEM和RPMI1640高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 HepG2和L02細(xì)胞系中HMGB1及RAGE表達(dá)的檢測(cè)：將HepG2和L02細(xì)胞系按1.5×106個(gè)/mL密度接種到60 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁之后提取細(xì)胞總蛋白。采用Western blot檢測(cè)兩株細(xì)胞中HMGB1及RAGE的表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參。用Quantity One軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2.4 rhHMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)：將HepG2細(xì)胞按1.0×104個(gè)/孔密度接種到96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，分別采用不同濃度重組人HMGB1蛋白(recombinant human HMGB1 protein，rhHMGB1)(0、10、50和100 μg/L)處理細(xì)胞24 h以及50 μg/L的rhHMGB1處理不同時(shí)間(0、12、24和36 h)。采用MTT試劑盒測(cè)定HepG2細(xì)胞增殖能力，自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。其中每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 rhHMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞RAGE和NF-κB表達(dá)影響的檢測(cè)：將對(duì)數(shù)增殖期HepG2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種到6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，分別采用不同濃度rhHMGB1(0、10、50和100 μg/L)處理細(xì)胞24 h以及50 μg/L的rhHMGB1處理不同時(shí)間(0、12、24和36 h)，每組設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot檢測(cè)不同處理組細(xì)胞RAGE和NF-κB的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參。用Quantity One軟件進(jìn)行光密度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HMGB1和RAGE在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

HMGB1和RAGE蛋白在肝癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率(蛋白表達(dá)樣本數(shù)/總樣本數(shù))為64%和72%，分別顯著高于癌旁組織的20%和28%(P<0.05)(表1，圖1)。

2.2 HepG2和L02細(xì)胞中HMGB1及RAGE的表達(dá)

HepG2細(xì)胞中HMGB1及RAGE的表達(dá)量均明顯高于L02細(xì)胞(圖2)。

2.3 rhHMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

隨著rhHMGB1濃度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞的增殖率顯著增強(qiáng)(圖3)。

2.4 HepG2細(xì)胞經(jīng)rhHMGB1處理后RAGE和NF-κB的表達(dá)

隨著rhHMGB1濃度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中NF-κB和RAGE的表達(dá)顯著上調(diào)(圖4)。

表1 HMGB1和RAGE在肝癌組織及正常 肝組織中的表達(dá)

*P<0.05 compared with normal liver tissues.

3 討論

HMGB1除了在多種炎性反應(yīng)中起重要調(diào)控作用外，在乳腺癌、前列腺癌和胃癌等腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起到了關(guān)鍵性的調(diào)控作用，通過(guò)其主要受體RAGE和Toll樣受體對(duì)下游一系列抑癌或促癌因子的作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-11]。而在肝臟相關(guān)腫瘤中，HMGB1的研究尚處于起步階段?，F(xiàn)有的大部分研究?jī)H從臨床病例及組織中得到HMGB1與肝癌的相關(guān)性，而從細(xì)胞及動(dòng)物模型上對(duì)HMGB1和RAGE在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起作用和相關(guān)機(jī)制尚缺乏深入研究。

A.HMGB1 expression in tumor tissues; B.HMGB1 expression in normal tissues; C.RAGE expression in tumor tissues; D.RAGE expression in normal tissues

圖1腫瘤與正常組織S-P免疫組化結(jié)果
Fig1S-Pimmunohistochemistryresultsoftumorandnormaltissues

*P<0.05 compared with control group

*P<0.05 compared with control group

本研究采用免疫組化的方法對(duì)肝癌組織和癌旁組織中HMGB1及RAGE的表達(dá)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，肝癌組織中HMGB1的表達(dá)陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于癌旁組織中。同時(shí)肝癌組織中RAGE的表達(dá)率也明顯高于癌旁組織。上述結(jié)果表明，HMGB1和RAGE在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)的趨勢(shì)。對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2和普通正常肝臟細(xì)胞系L02中HMGB1和RAGE表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，HepG2細(xì)胞中HMGB1和RAGE蛋白水平明顯高于L02細(xì)胞。這也與肝癌組織中HMGB1和RAGE高表達(dá)結(jié)果相一致。因此推斷HMGB1和RGAE對(duì)于肝癌的發(fā)生發(fā)展存在重要相關(guān)性。此外，向HepG2肝癌細(xì)胞系中加入rhHMGB1，采用MTT法檢測(cè)處于不同濃度rhHMGB1以及不同處理時(shí)間作用下HepG2細(xì)胞的增殖率，結(jié)果表明，隨著rhHMGB1濃度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞的增殖率顯著增強(qiáng)。同時(shí)，細(xì)胞中RAGE和NF-κB蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。這提示HMGB1能刺激HepG2肝癌細(xì)胞的增殖，HMGB1可能通過(guò)與其受體RAGE結(jié)合, 進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路, 從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。這也提示HMGB1-RAGE軸可能成為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。

總之，HMGB1-RAGE軸可能參與了人類肝癌的發(fā)生、發(fā)展及增殖機(jī)制，隨著對(duì)HMGB1-RAGE軸研究的深入，其可能成為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。