王綠音,楊慧敏，李晶，張慧，李懿，張偉，梁成罡,

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009

甘精胰島素是由重組DNA技術(shù)表達(dá)的具有長效作用的人胰島素類似物，適用于Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的治療[1]。甘精胰島素由2條肽鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量為6063.0。與人胰島素相比，它在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了如下2個(gè)變化：首先，用甘氨酸取代了A鏈21位的天冬酰胺；其次，在B鏈的C端添加了2個(gè)帶正電荷的精氨酸[2]。這些改變將甘精胰島素的等電點(diǎn)由人胰島素的5.4升高至6.7，皮下注射甘精胰島素后，在生理pH值條件下甘精胰島素的溶解度下降，分子聚集成六聚體形成藥物沉淀，緩慢持續(xù)地釋放少量甘精胰島素，從而產(chǎn)生長效、平穩(wěn)、無峰值的血藥濃度，有效控制空腹血糖，降低低血糖風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

肽圖分析是驗(yàn)證生物技術(shù)產(chǎn)品一級(jí)結(jié)構(gòu)完整性及正確性最有效的方法之一，同時(shí)也是考察產(chǎn)品的批間一致性及其工程菌遺傳穩(wěn)定性的重要手段。該項(xiàng)目系生物技術(shù)產(chǎn)品的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制有非常重要的意義[5]。V8蛋白酶是一種可特異性作用于谷氨酸C端的絲氨酸蛋白酶，在適宜條件下可特異性切割與甘精胰島素A鏈第4、17位，B鏈第13、21位的谷氨酸殘基C端相結(jié)合的肽鍵。甘精胰島素A、B鏈之間由2對(duì)二硫鍵連接，故水解后產(chǎn)生4個(gè)理論肽段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ）[6-8]（圖1）。目前各國藥典及國內(nèi)外企業(yè)均采用V8酶水解甘精胰島素，然后用RPHPLC分離4個(gè)目標(biāo)肽段得到其肽圖譜[9-10]。研究中發(fā)現(xiàn)，采用《歐洲藥典》9.5版（European Pharma?copoeia 9.5，EP9.5）甘精胰島素肽圖分析方法中的酶解條件，反應(yīng)的完全性及有效性不佳，從酶解后典型的色譜圖來看，主成分消化不完全，非特異酶解肽段含量較高，理論目標(biāo)肽段中的Ⅳ和Ⅰ含量過低，有時(shí)甚至無法有效檢出，無法確保除酶切位點(diǎn)外的其他序列的正確性及完整性[9]，不適于推廣為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。近年來各申報(bào)單位均舍棄了上述方法，以中國藥典2015年版（Chp2015）重組人胰島素肽圖分析方法[11]為基礎(chǔ)進(jìn)行甘精胰島素肽圖分析，但在酶解反應(yīng)的完全性、酶解產(chǎn)生的理論目標(biāo)肽段的穩(wěn)定性等方面仍然存在問題。因此，為滿足甘精胰島素日常質(zhì)控和科學(xué)監(jiān)管及評(píng)價(jià)需求，研究建立酶解反應(yīng)完全、特異性強(qiáng)、肽段分離效果好的甘精胰島素肽圖分析方法，具有充分的必要性和現(xiàn)實(shí)緊迫性。

圖1 甘精胰島素結(jié)構(gòu)圖及V8蛋白酶切位點(diǎn)

我們通過優(yōu)化酶解條件中的鹽濃度及pH值、酶量、反應(yīng)溫度與時(shí)間等關(guān)鍵因素，大大改善了甘精胰島素的酶解效果，建立了滿足上述要求的肽圖分析方法，根據(jù)Chp2015四部通則9101[12]藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行了專屬性、中間精密度、重復(fù)性及耐用性考察，并通過LC-MS對(duì)各肽段的色譜峰進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒別。為甘精胰島素產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)與申報(bào)提供技術(shù)支持及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)參考，也為新版中國藥典該品種肽圖鑒別質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂與提高打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

甘精胰島素樣品來自國內(nèi)外不同生產(chǎn)企業(yè)；甘精胰島素國家對(duì)照品（批號(hào)140701-20040）及B32脫精氨酸甘精胰島素對(duì)照品（410017-201701）均來自中國食品藥品檢定研究院；V8酶（1000 U/mg，1 mg/支，Worthington公司）；鹽酸、Tris、磷酸、硫酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氟乙酸（純度≥99.5% ，Alfa Aesar公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）。

精密稱取56.804 g硫酸鈉，溶于800 mL純水，磷酸調(diào)節(jié)pH2.3，加水定容至1 L，即為0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液。精密稱取4.8456 g Tris，溶于90 mL純水，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH9.0，加水定容至100 mL，即為0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液。吸取900 μL稀鹽酸于800 mL超純水中，定容至1 L，即為0.01 mol/L鹽酸溶液。取V8酶，加水制成5000 U/mL的溶液，分裝至0.5 mL離心管中，-20℃保存，用前取出。

LC-20A高效液相色譜儀（包括Prominence LC-20AD/20AT二元泵、Prominence SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、Prominence SPD-20A/20AV UV-VIS檢測(cè)器、LC-solution色譜工作站，島津公司）；Acquity UPLC超高效液相色譜-Xevo G2 Q Tof串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters公司）；HAAKE-S30不銹鋼加熱水浴循環(huán)器（Thermo Scientific公司）；ME155DU電子天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 甘精胰島素肽圖分析方法的建立

1.2.1 樣品處理 分別取甘精胰島素樣品及對(duì)照品原料適量，各加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至濃度為10 mg/mL的溶液。取20 μL 10 mg/mL的甘精胰島素樣品及對(duì)照品溶液，加至98 μL 0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）溶液中，加入 V8酶溶液（5000 U/mL）4 μL，純水78 μL，混勻，置37℃水浴中保溫1 h，取出后加入3 μL磷酸終止反應(yīng)，混勻，即為供試品及對(duì)照品溶液，4℃保存。

1.2.2 色譜條件 采用Waters Symmetry 300 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），以0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液（pH2.3）-乙腈（90∶10）為流動(dòng)相A、乙腈-水（50∶50）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，90% ～80% A；5～45 min，80% ～40% A；45～50 min，40% A），流速1 mL/min，檢測(cè)波長214 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 LC-MS條件 按上述方法處理樣品，對(duì)酶解產(chǎn)生的各肽段進(jìn)行液相色譜分離并收集，分別進(jìn)行LC-MS分析。

1.2.3.1 超高效液相色譜條件 采用Waters Ac?quity UPLC Peptide CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.1% 甲酸水溶液為流動(dòng)相A、0.1% 甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～6.95 min，95% ～60% A；6.95～7.29 min，60% ～95% A；7.29～10.50 min，95% A），流速0.3 mL/min，檢測(cè)波長214 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測(cè)模式，脫溶劑器溫度450℃，源溫80℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，cone電壓40 V，collision電壓Low CE 6eV，collision電壓High CE 6eV，數(shù)據(jù)采集范圍m/z為100～2000，采用MSE模式獲得各肽段母離子一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用LC-solution色譜工作站對(duì)樣品的理論肽段進(jìn)行積分，記錄肽段Ⅱ和Ⅲ的分離度及拖尾因子。通過計(jì)算各肽段的相對(duì)保留時(shí)間RRT（樣品肽段的保留時(shí)間與對(duì)照品肽段的保留時(shí)間的比率）對(duì)甘精胰島素進(jìn)行陽性鑒別。

用Masslynx 4.1軟件采集數(shù)據(jù)，用Biophaml?ynx 1.3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。選擇V8酶作為酶切試劑，選擇30 ppm的質(zhì)量偏差，漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為1，選擇N端焦谷氨酸環(huán)化為固定修飾。

1.3 甘精胰島素肽圖分析方法的優(yōu)化

對(duì)緩沖體系中的Tris濃度與pH值、酶量及酶解溫度與時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。選擇0.2 mol/L Tris-HCl（pH9.0）、0.4 mol/L Tris-HCl（pH8.0）及 0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）作為 3 個(gè)候選酶解緩沖液；酶量的考察，分別加入 2 μL（10 U）、4 μL（20 U）、6 μL（30 U）V8酶水解200 μg甘精胰島素；選擇45℃水浴1 h、37℃水浴0.5 h、37℃水浴1 h及37℃水浴2 h作為4個(gè)候選的酶解溫度與時(shí)間條件。所有實(shí)驗(yàn)均遵循改變其中1個(gè)條件其余保持不變的原則，取同一份樣品按上述不同條件下的制備方法處理后進(jìn)樣分析。

1.4 所建方法與現(xiàn)有方法的對(duì)比

方法1：按1.2.1項(xiàng)樣品處理方法及1.2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定甘精胰島素肽圖；方法2：按EP9.5甘精胰島素肽圖鑒別項(xiàng)下的樣品處理方法及1.2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定甘精胰島素肽圖；方法3：按Chp2015版重組人胰島素肽圖鑒別項(xiàng)下的樣品處理方法及1.2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定甘精胰島素肽圖。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專屬性 取0.01 mol/L鹽酸溶液代替樣品按上述方法處理，作為V8酶對(duì)照；取20 μL 10 mg/mL的甘精胰島素樣品，加至78 μL酶解緩沖液中，加入82 μL純水，水浴后終止反應(yīng)，作為甘精胰島素樣品對(duì)照；另取B32脫精氨酸甘精胰島素對(duì)照品，按上述方法加入V8酶處理，作為B32脫精氨酸甘精胰島素樣品對(duì)照。所有酶解后的樣品均按上述色譜條件進(jìn)行肽圖分析。

1.5.2 重復(fù)性（精密度） 取對(duì)照品溶液，按1.2.1項(xiàng)制備甘精胰島素樣品，消化后的溶液按1.2.2項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，考察甘精胰島素4個(gè)特征肽段保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.3 中間精密度 由2名實(shí)驗(yàn)者于同一時(shí)間按1.2.1方法制備2份樣品，由同一實(shí)驗(yàn)人員于不同時(shí)間同法制備3份樣品，每份樣品進(jìn)樣2次分析。

1.5.4 耐用性 取甘精胰島素對(duì)照品，按1.2.1項(xiàng)處理，分別加入V8酶15、20及25 U，得到加入不同酶量后的樣品消化溶液。對(duì)甘精胰島素對(duì)照品按1.2.1及1.2.2的方法酶解后分析，設(shè)置柱溫為38℃、40℃、42℃，得到不同柱溫下的樣品肽圖譜。此外，采用Waters Symmetry300、Aglient ZOR?BAX SB及Phenomenex Luna C18色譜柱對(duì)同一份樣品消化液進(jìn)行肽圖分析。

1.5.5 酶解后樣品的穩(wěn)定性 酶解后的甘精胰島素樣品存放于HPLC儀器的樣品室（6℃）中，于0、12、24 h各進(jìn)樣分析。將酶解后的樣品分裝后存放于-20℃，于0、1、7 d時(shí)，取出溶解并進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 甘精胰島素肽圖分析方法的建立

按1.2項(xiàng)下的方法分析甘精胰島素的肽圖，HPLC結(jié)果見圖2，色譜圖中主要包括4個(gè)理論肽段及3個(gè)非特異酶解肽段。通過與未處理的甘精胰島素樣品色譜圖比較，可確定肽段Ⅵ為未消化的主成分。其余2個(gè)非特異酶解肽段則被推測(cè)為位于肽段Ⅰ之后的Ⅳ+Ⅰ片段[2]及肽段Ⅰ′，通過下述LC-MS進(jìn)行鑒定。肽段Ⅱ和肽段Ⅲ的分離度大于25.0，且二者的拖尾因子均小于1.5，理論目標(biāo)肽段Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ的RRT均在1.00±0.01范圍內(nèi)。LC-MS分析得到的各肽段一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果見表1、圖3，肽段Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ的實(shí)測(cè)離子質(zhì)量與理論值一致。通過MSE高能量碎裂獲得的二級(jí)碎片b、y離子信息，確定了4個(gè)目的肽段氨基酸序列的正確性，證實(shí)了位于肽段Ⅰ之后的2個(gè)非特異酶解肽段分別為肽段Ⅳ+Ⅰ及Ⅰ′（圖4），該結(jié)果也與我們的推測(cè)一致。

圖2 新建方法測(cè)得的甘精胰島素肽圖譜

圖3 甘精胰島素肽段一級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 甘精胰島素Ⅰ+Ⅳ肽段、Ⅰ′肽段MSE譜圖

研究表明，肽段Ⅰ′在肽段Ⅰ之后出峰，是酶解過程中由肽段Ⅰ的A鏈N端第5位谷氨酰胺自身環(huán)化形成的焦谷氨酸衍生物Glp（A5）-I[8]。該衍生物來源于肽段Ⅰ，其生成量與環(huán)境溫度、pH值密切相關(guān)[13-14]，本研究以肽段Ⅰ′與Ⅰ的峰面積之比作為衡量肽段Ⅰ穩(wěn)定性的指標(biāo)。計(jì)算圖2中Ⅰ′與Ⅰ的峰面積比值為0.05% ，表明采用本方法酶解所得的肽段Ⅰ的穩(wěn)定性較好。

以未消化的主成分比率（肽段Ⅵ與較為穩(wěn)定的肽段Ⅱ的峰面積之比）作為衡量酶解完全性的指標(biāo)。計(jì)算圖2中肽段Ⅵ與Ⅱ的峰面積比值為0.05% ，表明采用本方法測(cè)得的未消化的主成分含量較低，酶解的完全性較好。

2.2 甘精胰島素肽圖分析方法的優(yōu)化

對(duì)酶解條件中的幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以不同條件得到的非特異酶解肽段（未消化的主成分、片段Ⅳ+Ⅰ和片段Ⅰ′）的含量作為判定候選條件優(yōu)劣的指標(biāo)。由圖5可見，采用0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）作為酶解緩沖液處理樣品，非特異酶解肽段的含量最低，酶解最為完全。

當(dāng)體系中加入 V8酶的量為 4 μL（20 U）時(shí)（圖6），主成分的酶解程度優(yōu)于2 μL（10 U），且與加入6 μL（30 U）時(shí)的酶解程度相當(dāng)。低酶量（10 U）導(dǎo)致的不完全酶解使得肽段Ⅵ+Ⅰ的含量顯著高于20～30 U酶量條件下該肽段的含量。此外，由于酶量增多，酶解更加完全，加入6 μL（30 U）V8酶產(chǎn)生的肽段Ⅵ+Ⅰ的量略低于4 μL（20 U）條件，但二者相差不大，故選擇4 μL（20 U）作為最佳酶量。

在4個(gè)酶解溫度與時(shí)間條件中，37℃反應(yīng)0.5 h及45℃反應(yīng)1 h得到的片段Ⅳ+Ⅰ的量明顯高于于另外2個(gè)條件。此外，37℃反應(yīng)2 h所得的片段Ⅳ+Ⅰ的量略低于37℃反應(yīng)1 h，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長，片段Ⅳ+Ⅰ被酶切得更加充分。然而隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的延長，水解衍生物焦谷氨酸（Ⅰ′）增多，綜合實(shí)驗(yàn)效率及酶解效果，選擇37℃水浴1 h為最佳反應(yīng)條件（圖7）。

表1 甘精胰島素主要肽段及離子化信息

2.3 所建方法與現(xiàn)有方法的對(duì)比

比較采用所建方法、EP9.5甘精胰島素肽圖分析法、Chp2015重組人胰島素肽圖分析法中的酶解條件處理樣品，并按照1.2.2項(xiàng)色譜圖條件測(cè)定的肽圖。Chp（圖8A）及本方法（圖8C）的色譜圖可清晰地呈現(xiàn)4個(gè)理論肽段，而EP9.5方法的色譜圖（圖8B）中肽段Ⅰ和Ⅳ無法被有效檢出。

在酶解反應(yīng)的完全性方面，計(jì)算3種方法測(cè)定的未消化的主成分比率（肽段Ⅵ與Ⅱ的峰面積之比），其中本方法（圖8C）的未消化主成分比率為0.05% ，遠(yuǎn)低于Chp（圖8A）的0.23% 及EP9.5（圖8B）的1.14% ，表明3種方法中，Chp方法的酶解效率高于EP9.5，而新方法的酶解反應(yīng)效率最高，酶解完全性更好。3種方法中肽段Ⅵ+Ⅰ的含量差異也很好地佐證了上述結(jié)論，其中EP9.5方法中肽段Ⅳ+Ⅰ的含量更是高至與主要肽段Ⅲ相當(dāng)。

圖5 用不同酶解緩沖液酶解后的甘精胰島素肽圖譜

圖6 用不同酶量酶解后的甘精胰島素肽圖譜

圖7 用不同酶解溫度和時(shí)間酶解后的甘精胰島素肽圖譜

在酶解產(chǎn)生肽段的穩(wěn)定性方面，考察3種方法所得肽段Ⅰ的穩(wěn)定性，計(jì)算Ⅰ′與Ⅰ的峰面積比值，本方法（圖8C）為0.05% ，遠(yuǎn)低于Chp（圖8A）的0.09% ，表明本方法肽段Ⅰ的穩(wěn)定性更好。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性 專屬性考察結(jié)果表明V8酶對(duì)照在樣品各肽段出峰時(shí)間均無干擾峰出現(xiàn)（圖9E）。B32脫精氨酸甘精胰島素肽圖譜中的肽段Ⅲ′與甘精胰島素的肽段Ⅲ相比，僅在B鏈C端缺失一個(gè)親水的精氨酸，導(dǎo)致肽段Ⅲ′疏水性增強(qiáng)，出峰時(shí)間明顯晚于甘精胰島素的肽段Ⅲ（圖9B），2種胰島素對(duì)照樣品的結(jié)果也與之對(duì)應(yīng)（圖9C、D）。這些結(jié)果表明本方法分辨率較高，可精準(zhǔn)反映甘精胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的正確性，專屬性較好。

圖8 3種酶解方法測(cè)得的甘精胰島素肽圖譜

2.4.2 重復(fù)性（精密度） 考察甘精胰島素4個(gè)特征肽段保留時(shí)間和峰面積的RSD，由表2可見，各肽段保留時(shí)間及峰面積的RSD均≤0.20% ，表明方法的精密度較好，符合肽圖分析的技術(shù)要求。

2.4.3 中間精密度 以樣品中各肽段的相對(duì)保留時(shí)間（色譜圖上樣品特征峰的保留時(shí)間與對(duì)照品對(duì)應(yīng)峰的保留時(shí)間之比）的RSD作為評(píng)價(jià)中間精密度的指標(biāo)，結(jié)果見表3。各肽段相對(duì)保留時(shí)間均在1.00±0.01范圍內(nèi)，RSD為0.12% ～0.26% ，表明不同人員及不同時(shí)間下制備樣品測(cè)得結(jié)果的變異程度較小，方法的中間精密度良好。

2.4.4 耐用性 耐用性考察結(jié)果見表4，當(dāng)反應(yīng)體系中的酶量與色譜條件中的柱溫發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)，各肽段相對(duì)保留時(shí)間均在1.00±0.01范圍內(nèi)，RSD為0.01% ～0.36% 。此外，對(duì)同一份樣品采用不同品牌的色譜柱測(cè)定，各肽段的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.35% ，肽段Ⅲ與Ⅱ的拖尾因子均小于1.3，分離度均大于25.0（圖6）。這些結(jié)果表明上述測(cè)定條件微小變化時(shí)，測(cè)定結(jié)果受影響的程度不大，方法的變異度低，耐用性較好。

2.4.5 酶解后樣品的穩(wěn)定性 考察了樣品的儲(chǔ)存穩(wěn)定性（6℃）及凍存（-20℃）穩(wěn)定性。由表5可見，樣品消化液于6℃存放24 h及-20℃條件下儲(chǔ)存7 d后，測(cè)定結(jié)果依然較穩(wěn)定。

表2 重復(fù)性（精密度）考察結(jié)果（n=6）

表3 中間精密度考察結(jié)果（n=6）

3 討論

肽圖分析作為控制基因重組藥物一致性的重要手段，對(duì)重組蛋白的結(jié)構(gòu)確證和專屬性鑒別具有重要意義[15-17]。該方法常通過酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽段碎片，然后對(duì)碎片進(jìn)行可重現(xiàn)的分離及鑒定，包括蛋白質(zhì)前處理、酶解、特征肽段的分離及鑒別這3個(gè)主要步驟。一個(gè)好的肽圖分析方法，除須具備高度的特異性、可鑒定酶切位點(diǎn)處序列信息的正確性以外，還應(yīng)具備酶解反應(yīng)完全、理論目標(biāo)肽段分離度良好且清晰可辨、理論目標(biāo)肽段在酶解體系中穩(wěn)定性較好、非特異酶解肽段的含量較低等特點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)中單一氨基酸的氧化、脫氨等變化的精確檢測(cè)。

圖9 專屬性色譜圖

表4 耐用性考察結(jié)果（n=3）

表5 酶解后樣品的穩(wěn)定性考察結(jié)果（n=3）

現(xiàn)行的甘精胰島素肽圖分析藥典方法收載于EP9.5，該方法在酶解的完全性及理論目標(biāo)肽段的檢出等方面存在問題，因此各申報(bào)單位紛紛參考Chp2015重組人胰島素肽圖分析方法。該方法適用于等電點(diǎn)為5.4的重組人胰島素，對(duì)于等電點(diǎn)為6.2的甘精胰島素而言，仍存在樣品無法完全溶解、非特異酶解肽段含量較高等缺陷。研究中發(fā)現(xiàn)，提高緩沖體系中的鹽濃度與pH值，可增加甘精胰島素樣品的溶解度，從而在一定程度上降低未消化的主成分的含量。此外，溫度越高、pH值越低，酶解過程中產(chǎn)生的焦谷氨酸衍生物也會(huì)增多。因此，充分考察并對(duì)這些影響酶解效果的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于甘精胰島素肽圖分析方法的建立至關(guān)重要。

本研究對(duì)酶解條件中的關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化，包括緩沖體系中的鹽濃度和pH值、V8蛋白酶的量、酶促反應(yīng)溫度與時(shí)間，最終確定了最佳酶解條件。在該條件下，酶解反應(yīng)更充分，甘精胰島素完整蛋白基本被完全酶解，非特異酶解肽段產(chǎn)生較少，較大程度地降低了其對(duì)表征理論目標(biāo)肽段的干擾。比較采用本方法與EP9.5甘精胰島素、Chp2015重組人胰島素肽圖分析方法的酶解條件測(cè)得的肽圖譜可見，本方法在酶解反應(yīng)的完全性、特異性、酶解產(chǎn)生肽段的穩(wěn)定性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。通過LC-MS法對(duì)酶解產(chǎn)生的各目標(biāo)肽段進(jìn)行了確證，并且首次對(duì)2個(gè)酶解產(chǎn)生的非特異肽段（Ⅰ+Ⅳ及Ⅰ′）進(jìn)行了鑒別。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法對(duì)甘精胰島素有很好的專屬性，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD在0.20% 以內(nèi)，中間精密度試驗(yàn)測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.01% ～0.36% 。此外，酶量及柱溫的微調(diào)、更換不同品牌的色譜柱等并未給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來明顯變化，表現(xiàn)了良好的耐用性。且酶解后樣品溶液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性及凍存穩(wěn)定性均較好。以上數(shù)據(jù)顯示該方法適于相應(yīng)檢測(cè)要求，具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性和可靠性，可以達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

綜上，我們建立了良好的甘精胰島素肽圖分析方法，該方法可作為甘精胰島素結(jié)構(gòu)確證與一致性比較的常規(guī)檢驗(yàn)方法，并廣泛用于工藝開發(fā)、過程控制與終產(chǎn)品的放行檢驗(yàn)。本研究為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也可為其他胰島素類產(chǎn)品的肽圖鑒別提供參考。