冷曉燕,段云飛,段穎,徐燕,常菁
江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司,江蘇 無(wú)錫 214000
創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及皮膚缺損部位的再上皮化、肉芽組織的增生、炎癥反應(yīng)、血管增生和創(chuàng)面重塑等,其中任何一個(gè)過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題,都會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面愈合障礙[1-2]。在創(chuàng)面愈合過(guò)程中,生長(zhǎng)因子扮演著非常重要的角色,這是由于它們?cè)隗w外具有獨(dú)特的、能夠刺激靜止期細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行有絲分裂的能力,在這一復(fù)雜的過(guò)程中,生長(zhǎng)因子的調(diào)控非常精細(xì),它們能對(duì)傷口愈合的各個(gè)時(shí)期產(chǎn)生影響,從而加快愈合速度[3]。然而,應(yīng)用高劑量單一因子治療難愈性創(chuàng)面雖然能在一定程度上緩解患者病情,但調(diào)控機(jī)制單一,且價(jià)格昂貴,因此限制了其臨床應(yīng)用。有學(xué)者對(duì)臍帶來(lái)源的干細(xì)胞上清液中的成分進(jìn)行了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)實(shí)驗(yàn)分析,結(jié)果表明該上清液中含有多種細(xì)胞因子,如大量的IL-6、IL-8、MCP-1、TIMP-1、GM-CSF、TGF-β1等[4],這些因子在創(chuàng)面愈合過(guò)程中非常重要。
本實(shí)驗(yàn)中,我們將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hu?man umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)上清凝膠直接作用于活體創(chuàng)面,觀察是否會(huì)影響創(chuàng)面的再次上皮化、肉芽組織增生、炎癥反應(yīng)、血管增生和創(chuàng)面重塑等過(guò)程,探討干細(xì)胞上清對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合的影響,研究hUC-MSCs上清與動(dòng)物創(chuàng)面愈合的關(guān)系,以及促進(jìn)創(chuàng)面愈合的合理蛋白含量,旨在為臨床促進(jìn)創(chuàng)面愈合尋找新的藥物和新的治療方法。
健康新生兒臍帶取自解放軍101醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的胎兒;雌性ICR小鼠40只,體質(zhì)量25~30 g,由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;α-MEM、胎牛血清(FBS)(BI公司);CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR單克隆抗體(BD公司);RNA Simple Total RNA kit、Quantscript RT kit(大連寶生物公司);動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(天根公司);常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀(BD公司);引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
從手術(shù)室取得新鮮健康新生兒臍帶,用PBS沖洗干凈,用剪刀鑷子剔去血管,剝出里面的華氏膠組織,充分剪碎至1 mm3大小,加入α-MEM培養(yǎng)液,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液中含10% FBS,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。
將原代細(xì)胞消化下來(lái)后,加PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL,取200 μL細(xì)胞懸液按組合方案分別加入5 μL熒光標(biāo)記的單抗(CD90-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD34-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE)混勻,室溫避光孵育20 min,上機(jī)檢測(cè)。
取第3代細(xì)胞消化傳代后,以約1.0×105/孔接種到6孔板中,成脂、成骨分化及對(duì)照各2孔,待細(xì)胞貼壁后,向分化組加入相應(yīng)的分化培養(yǎng)液。成骨分化培養(yǎng)基中含1.0×10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β磷酸甘油;成脂分化培養(yǎng)基中含10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、50 μg/mL抗壞血酸、10 μg/mL胰島素注射液、0.2 mmol/L吲哚美辛。每3~4 d換液1次,分化4周后,用4% 低聚甲醛將細(xì)胞固定,分別用茜素紅染液和油紅O染色,蘇木精復(fù)染,于顯微鏡下觀察。
直接向6孔板的每孔細(xì)胞內(nèi)加1 mL TRN?zol,吹打混勻后用氯仿-異丙醇法提取總RNA,采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95℃ 5 min,以95℃變性30 s、不同溫度退火30 s、72℃延伸30 s行35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。
當(dāng)?shù)?代細(xì)胞長(zhǎng)至70% 匯合度時(shí),用不含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基(α-MEM)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞上清液,用蛋白電泳方法檢測(cè)胎牛血清殘留量,以將胎牛血清耗盡的培養(yǎng)時(shí)間為止,將收集的液體1000 r/min離心5 min,分裝到15 mL離心管中,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行鹽析,收集蛋白沉淀,加水溶解后過(guò)濾,將葡聚糖凝膠柱G-25(5 cm×60 cm)連接AKTA蛋白純化儀,用含0.15 mol/L NaCl的去離子水作為洗脫劑,對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除鹽、脫色處理。將收集到的樣品用0.22 μm濾膜過(guò)濾后于4℃保存。總蛋白濃度檢測(cè)采用BCA法。
表1 GAPDH、Oct4、Sox2引物序列
將收集到的純化上清用凍干機(jī)凍干成粉,用無(wú)菌水將凍干粉溶解為濃度19 g/L的蛋白凝縮液。3% 甲基纖維素(MC)與1.3 g/L純化上清等體積混合即為低劑量凝膠劑,3% MC與19 g/L純化上清(凍干濃縮而成)等體積混合即為高劑量凝膠劑。
將ICR小鼠用4% 水合氯醛麻醉,用剃毛器除去背部被毛,采用5 mm皮膚打孔器于小鼠背部制備2個(gè)對(duì)稱(chēng)的皮膚創(chuàng)傷模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成空白對(duì)照組(10只,實(shí)驗(yàn)期間傷口不給予任何處理)、溶劑對(duì)照組(10只,實(shí)驗(yàn)期間傷口給予3% 甲基纖維素處理)、實(shí)驗(yàn)材料組[共20只,分為Ⅰ組(10只,實(shí)驗(yàn)期間傷口給予低劑量凝膠劑處理)、Ⅱ組(10只,實(shí)驗(yàn)期間傷口給予高劑量凝膠劑處理)]。
進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)后小鼠分籠飼養(yǎng),每天觀察進(jìn)食情況、創(chuàng)面變化及愈合情況,計(jì)算創(chuàng)面愈合率。
第3、6、8、15 d留取各組切口處含兩側(cè)1 cm范圍圈層皮膚組織制作石蠟切片,HE染色,評(píng)估不同組別切口愈合的大體情況。第3、6、8、15 d留取各組切口處含兩側(cè)1 cm范圍圈層皮膚組織制作石蠟切片,Masson三色染色,評(píng)估不同組別切口愈合過(guò)程中膠原形成的大體情況。
白細(xì)胞介素1β(IL-1β)是具有代表性的炎性因子,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)力生長(zhǎng)因子,VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。另外,Ⅰ型膠原(Col1)是機(jī)體主要的結(jié)構(gòu)膠原,由2條α1鏈(Col1a1)和1條α2鏈(Col1a2)組成三螺旋結(jié)構(gòu)[5]。Col1a1在Ⅰ型膠原合成過(guò)程中起著極其重要的作用,而皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程也與膠原纖維的形成息息相關(guān)[6]。我們采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取愈合組織總mRNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)。Q-PCR檢測(cè)則借助熒光定量PCR試劑盒,設(shè)置程序:95℃預(yù)變性15 min;95℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s,40次循環(huán);擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線制作,確保擴(kuò)增的特異性。引物序列見(jiàn)表2。
表2 TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β、β-actin引物序列
臍帶組織培養(yǎng)5~7 d后,可見(jiàn)有部分細(xì)胞從組織塊周?chē)莱?,形態(tài)呈細(xì)小的梭形,1周后細(xì)胞開(kāi)始迅速增殖,形成大小不等的細(xì)胞集落,10 d左右去掉組織塊,15 d左右可鋪滿培養(yǎng)瓶的90% 。傳代后的細(xì)胞呈纖維狀生長(zhǎng),如圖1。
圖1 第3代hUC-MSCs(100×)
流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,hUC-MSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105,不表達(dá)CD34、CD45、HLADR(圖2)。
圖2 流式細(xì)胞儀鑒定原代hUC-MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)
成脂誘導(dǎo)分化1周后,顯微鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)有少量脂滴形成,4周后,油紅O染色可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)有較多油滴空泡;成骨分化4周后,細(xì)胞大量重疊成團(tuán)處被染成深紅色的“鈣結(jié)節(jié)”(圖3)。
圖3 hUC-MSCs成脂(A)和成骨(B)體外誘導(dǎo)分化
RT-PCR后電泳檢測(cè)顯示,第2代和第5代hUC-MSCs都表達(dá)Oct4和Sox2(圖4)。Oct4、Sox2是胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志基因,對(duì)維持干細(xì)胞特性具有重要作用,表明hUC-MSCs具有干細(xì)胞特性。
2.5.1 小鼠皮膚創(chuàng)面的宏觀所見(jiàn) 打孔造模當(dāng)天,創(chuàng)口邊緣整齊,傷口紅腫,可見(jiàn)明顯出血及滲液,創(chuàng)口較為濕潤(rùn);第1 d,創(chuàng)口已無(wú)滲血、滲液,創(chuàng)口皮膚干燥,大部分小鼠傷口可見(jiàn)一層膜狀物,少數(shù)已結(jié)痂;第2 d,各組小鼠傷口均可見(jiàn)完整痂皮覆蓋,顏色較淺,質(zhì)地較軟;第3 d,傷口邊緣開(kāi)始收縮,起皺,傷口周?chē)t腫消退;第4 d,痂皮顏色普遍加深,傷口面積明顯縮小;第5~7 d,痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離,部分已剝脫,創(chuàng)口表面由增生的上皮覆蓋,傷口面積進(jìn)一步縮??;第8~9 d,痂皮陸續(xù)脫落,愈合程度快慢不一;第10 d,所有小鼠痂皮都已脫落,傷口呈線形愈合,明顯短縮;第15 d,創(chuàng)口已完全愈合,部分小鼠創(chuàng)口皮膚稍隆起,質(zhì)地較韌。
2.5.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間和創(chuàng)面愈合率 每天觀察各組動(dòng)物的創(chuàng)面愈合情況,以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合時(shí)間的依據(jù)。每組于傷后1、3、5、7、9 d隨機(jī)取5只ICR小鼠進(jìn)行創(chuàng)面拍照(圖5),用Im?age J圖像分析軟件,用手動(dòng)方式標(biāo)記未愈合創(chuàng)面的邊緣,運(yùn)用軟件自動(dòng)算出愈合創(chuàng)面的大小。創(chuàng)面愈合率=(最初創(chuàng)面大小-未愈合創(chuàng)面大小)/最初創(chuàng)面大小×100% 。不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率見(jiàn)表3,將不同時(shí)間點(diǎn)的3組創(chuàng)面愈合率分別與空白對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),高劑量組于創(chuàng)傷后第5 d創(chuàng)面愈合率為67.1% ±6.6% ,第7 d為78.1% ±5.8% ,均分別顯著高于空白對(duì)照組第5 d(58.6% ±12.6% )和第7 d(71.8% ±9.2% ),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),第3、9 d的創(chuàng)面愈合率無(wú)明顯差別。
圖4 hUC-MSCs的Oct4和Sox2基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖
圖5 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況
2.6.1 HE染色 常規(guī)HE染色可見(jiàn),第3 d血痂與已經(jīng)增厚的創(chuàng)緣皮膚分離,創(chuàng)面可見(jiàn)明顯的肉芽組織形成,梭形成纖維細(xì)胞開(kāi)始增生,各組差異不明顯;第6 d實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組多,總體來(lái)說(shuō)細(xì)胞數(shù)量減少,各組小鼠傷口處仍有厚痂,但已開(kāi)始剝離傷口;第8 d創(chuàng)面周?chē)黠@上皮化,創(chuàng)面面積明顯縮小,實(shí)驗(yàn)組(高劑量和低劑量組)已填滿整個(gè)傷口區(qū)域,對(duì)照組可見(jiàn)肉芽組織形成,但不完整;第15 d創(chuàng)口(圖6)基本愈合,原先的創(chuàng)口已完全被表皮覆蓋,表皮均質(zhì)變薄,低劑量組傷口寬度明顯小于對(duì)照組,高劑量組傷口處細(xì)胞層次變多,更接近于正常皮膚組織,少數(shù)高劑量組個(gè)體傷口處出現(xiàn)毛囊汗腺等皮膚附屬器官。
2.6.2 Masson染色 創(chuàng)面新生組織切片經(jīng)Masson三色染色后觀察,傷后3~8 d出現(xiàn)肉芽組織,膠原纖維增生不明顯;傷后15 d,膠原纖維增生顯著(圖7,箭頭示膠原纖維,呈藍(lán)色)??瞻捉M和MC組術(shù)后15 d,新生真皮膠原積累松散,多呈彌漫狀,規(guī)則積累的膠原蛋白較少。低劑量和高劑量組真皮有粗大并明顯走向的膠原纖維,真皮膠原積累優(yōu)于對(duì)照組。
實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠皮膚切創(chuàng)傷口組織中TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果見(jiàn)圖8。傷后第2 d,高劑量上清處理的小鼠傷口組織TGF-β1和Col1a1基因表達(dá)增加,明顯多于對(duì)照組(P<0.05),到第3 d時(shí)降至正常水平,與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。此外,傷后第3 d,實(shí)驗(yàn)組(高劑量和低劑量組)VEGF的表達(dá)量均高于對(duì)照組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而IL-1β基因的表達(dá),可以看到高劑量組從第3 d開(kāi)始顯著低于空白對(duì)照組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表3 不同時(shí)間點(diǎn)ICR小鼠創(chuàng)面愈合率(% )
研究表明,機(jī)體組織在損傷的每個(gè)時(shí)期都有不同的細(xì)胞因子在發(fā)揮作用,如引起組織收縮、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、決定浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞的種類(lèi)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的程度、誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞分化及肉芽組織形成、誘導(dǎo)上皮組織形成等。因此,檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組損傷處組織中各種與損傷修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況可以反映出創(chuàng)傷愈合的作用機(jī)制,即通過(guò)什么途徑促進(jìn)傷口愈合[7]。通過(guò)創(chuàng)面愈合率的計(jì)算,我們發(fā)現(xiàn)傷后的初期和后期,各組小鼠傷口面積差異不明顯,傷口愈合依賴(lài)于各基因表達(dá)產(chǎn)物來(lái)有序調(diào)控,而表達(dá)產(chǎn)物的積累需要一定的時(shí)間,所以早期高劑量組和對(duì)照組傷口愈合率無(wú)差異,而小鼠皮膚自身具有很強(qiáng)的修復(fù)能力,到了后期,即便對(duì)照組傷口也已基本愈合,所以9 d時(shí)高劑量組與對(duì)照組也無(wú)明顯差異。在3~9 d之間,高劑量組的優(yōu)勢(shì)在外觀上得以顯示,愈合率顯著高于空白對(duì)照組。病理切片使我們能夠觀察到傷口深層次的變化,初期各組病理形態(tài)大體相同,此后實(shí)驗(yàn)組同期的修復(fù)情況要好于對(duì)照組,體現(xiàn)在成纖維細(xì)胞數(shù)量更多,肉芽組織出現(xiàn)得更早更明顯。Masson染色可以幫助我們更好地觀察膠原纖維的積累,藍(lán)色越深代表膠原纖維越多。已有研究證實(shí),VEGF可以促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集,刺激多種炎性分子的釋放,提高血管的通透性,從而加重炎性反應(yīng)。而持續(xù)的炎性反應(yīng)可能刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌大量的膠原,從而促進(jìn)了病理性瘢痕的形成。在15 d的Masson病理切片上,我們看到實(shí)驗(yàn)組的藍(lán)色更深,膠原的積累是瘢痕形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[8],我們處死小鼠前還未見(jiàn)到傷口出現(xiàn)明顯的瘢痕疙瘩,因?yàn)槭聦?shí)上瘢痕的形成需要更長(zhǎng)的時(shí)間。
圖6 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合15 d(HE染色,箭頭示創(chuàng)面位置)
圖7 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合15 d(Masson染色)
圖8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)傷后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因表達(dá)水平變化
由實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果,可以推測(cè)在小鼠皮膚創(chuàng)傷發(fā)生后的早期,也就是第2~3 d,我們制備的干細(xì)胞上清凝膠促進(jìn)了TGF-β1、Col1a1、VEGF基因的表達(dá)。TGF-β1能直接刺激成纖維細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(包括纖維連接蛋白)、膠原、氨基葡糖等的合成,并對(duì)新合成的細(xì)胞基質(zhì)的降解具有明顯的抑制作用;局部注射TGF-β1可以促進(jìn)傷口愈合和典型肉芽組織形成[9]。TGF-β1作為趨化因子,推動(dòng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、膠原積累。Col1a1表達(dá)量增加又進(jìn)一步加速了膠原的形成。創(chuàng)傷修復(fù)須經(jīng)歷炎性反應(yīng)、肉芽組織形成及組織重塑等主要階段,每一階段都有血管及其相關(guān)生物活性物質(zhì)的參與,新生血管對(duì)于創(chuàng)面愈合起著至關(guān)重要的作用,為快速生長(zhǎng)的細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)支持,以促進(jìn)創(chuàng)傷組織的修復(fù)[8]。VEGF與肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞上的血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖和遷移,促進(jìn)血管構(gòu)建和生成。在造模后3 d,我們從病理切片上確實(shí)觀察到此時(shí)大量肉芽組織形成和成纖維細(xì)胞的聚集,與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果相印證。這些作用都加快了實(shí)驗(yàn)組,特別是高劑量組小鼠創(chuàng)面的修復(fù)速率。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷修復(fù)后期,高劑量組的IL-1β這一炎癥因子表達(dá)水平降低。已有研究表明,小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合初期,傷口出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),隨著傷口愈合,炎性細(xì)胞逐漸減少直至消失[10]。據(jù)此推測(cè),高劑量的hUC-MSCs上清凝膠加速了傷口愈合,使得炎癥反應(yīng)提前消退,炎性細(xì)胞在高劑量組小鼠傷口組織中更早消失。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了人臍帶來(lái)源干細(xì)胞上清凝膠能夠有效加速小鼠皮膚創(chuàng)面愈合,但其具體機(jī)制還須深入研究。