廖翔，何景龍，李洪波

北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司，北京 100071

犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）屬于細(xì)小病毒科，于1978年分離自患腸炎的犬類糞便。CPV感染會引起犬細(xì)小病毒腸炎，是全球范圍流行的犬類烈性傳染病之一[1]，同時(shí)也是包括大熊貓?jiān)趦?nèi)的珍稀瀕危動(dòng)物的主要烈性傳染病。其病程短、傳染性強(qiáng)、死亡率高，對犬類危害很大，需要有快速準(zhǔn)確的檢測方法，以便及時(shí)治療。

目前CPV的快速檢測方法主要有基于血清蛋白的免疫性檢測[2]和針對病毒DNA的基因檢測?；驒z測包括常規(guī)PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR檢測[3]，以及近幾年發(fā)展較快的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification,LAMP）[4-7]。

LAMP[8]是Notomi等發(fā)明的一種恒溫?cái)U(kuò)增方法，其特點(diǎn)是降低了對儀器的要求，只需要一個(gè)水浴鍋等恒溫設(shè)施即可反應(yīng)。然而，常規(guī)LAMP仍需要專門的檢測設(shè)備，不便現(xiàn)場檢測。

根據(jù)DNA聚合酶在擴(kuò)增過程中每延伸一個(gè)堿基會釋放一個(gè)氫離子，從而使溶液pH值逐漸降低的原理，我們建立了一種pH敏感指示劑中性紅檢測犬細(xì)小病毒的LAMP方法。本方法只需恒溫?cái)U(kuò)增儀器，即恒溫水浴或金屬浴，不需要檢測儀器，40 min完成LAMP，陰性反應(yīng)保持初始淡黃色狀態(tài)，陽性擴(kuò)增反應(yīng)液則會變?yōu)樽霞t色，肉眼即可分辨陽性擴(kuò)增和陰性反應(yīng)，非常方便現(xiàn)場快速病毒檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

犬細(xì)小病毒DNA樣品由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所惠贈；金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)志賀菌、坂崎腸桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的DNA由浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院惠贈；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC-CPV由上海捷瑞公司合成；1×RM LAMP（含Eva Green）反應(yīng)液、可視化1×RM LAMP（含中性紅）反應(yīng)液和2×PCR TaqMix由北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；DL2000 DNA marker為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；Bst2.0 DNA聚合酶購自NEB公司；熒光定量PCR儀為Roche公司的LightCycler 480II。

1.2 引物設(shè)計(jì)和合成

采用Primer Premier 5.0程序設(shè)計(jì)LAMP引物CPV-F3（5′-TGGGATAAAGAATTTGATACTGA-3′）、CPV-B3（5′-TGAGAGGCTCTTAGTTTAGCTTT-3′）、CPV-FIP（5′-CGCAACTTTTACAAATAATTGACCATT AAAACCAAGACTTCATGTAAATGC-3′）、CPV-BIP（5′-AACAAATGAATATGATCCTGATGCAACCTTTCC ACCAAAAATCTGAGT-3′）、CPV-FLP（5′-GGACAAT TATTTTGACAAACAAATGG-3′）、CPV-BLP（5′-TCT GCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3′），由上海捷瑞公司合成。

國標(biāo)犬細(xì)小病毒病診斷技術(shù)[9]上游引物為CPVF（5′-GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC-3′），下游引物為 CPVR（5′-GTGCACTATAACCAACCTCAGC-3′），由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

用純水將所有引物溶解為100 μmol/L濃度的母液，然后配制LAMP用引物混合物CPV-PM，含 CPV-FIP、CPV-BIP 各 32 μmol/L，CPV-FLP、CPV-BLP、CPV-F3和 CPV-B3各 4 μmol/L。每20 μL LAMP 反應(yīng)體系加入1 μL CPV-PM。國標(biāo)引物根據(jù)國標(biāo)要求配制。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

捷瑞公司合成并提供的pUC-CPV質(zhì)粒為5 μg干粉，用50 μL純水溶解，濃度為100 ng/μL。質(zhì)粒大小為3200 bp，其相對分子質(zhì)量計(jì)算為3200×660=2.1×106。根據(jù)公式［質(zhì)?？截悢?shù)=（質(zhì)量濃度÷分子量）×6.02×1023］計(jì)算拷貝數(shù)，將質(zhì)粒稀釋至1×103、1×102、1×101拷貝/μL作為擴(kuò)增反應(yīng)的陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量LAMP

每 17 μL 1×RM LAMP 反應(yīng)液中加入 1 μLBst2.0 DNA聚合酶、1 μL CPV-PM、1 μL pUC-CPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，混勻后加入384孔板，蓋上透明封口膜，置LightCycler 480II中進(jìn)行LAMP反應(yīng)和高分辨熔解曲線（HRM）分析。檢測模式為SYBR Green I/HRM Dye，LAMP條件為65℃恒溫反應(yīng)60 min，每20 s檢測1次熒光值；擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM分析，溫度范圍60～95℃，分辨率為每攝氏度讀取熒光5次。

1.5 可視化LAMP檢測方法

每17 μL可視化LAMP 1×RM反應(yīng)液中加入1 μLBst2.0 DNA 聚合酶、1 μL CPV-PM、1 μL pUC-CPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，混勻后于65℃恒溫烘箱中反應(yīng)40 min，肉眼觀察擴(kuò)增結(jié)果，拍照記錄。

1.6 病毒樣本檢測和測序驗(yàn)證

分別用可視化LAMP和實(shí)時(shí)熒光定量LAMP檢測犬細(xì)小病毒DNA樣品。對于檢測為陽性的樣品，用引物CPV-F3和CPV-B3進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，委托測序公司對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.7 國標(biāo)方法檢測病毒樣本

用國標(biāo)犬細(xì)小病毒檢測技術(shù)[9]檢測犬細(xì)小病毒的DNA，PCR完成后進(jìn)行電泳，并拍照記錄。

1.8 可視化LAMP檢測方法特異性試驗(yàn)

用本研究建立的可視化LAMP方法對犬細(xì)小病毒陽性DNA及金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)志賀菌、坂崎腸桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的DNA進(jìn)行特異性檢測，并將反應(yīng)結(jié)果拍照記錄。

報(bào)警裝置采用模塊化設(shè)計(jì),包括聲光報(bào)警單元、電量檢測模塊、充電保護(hù)模塊、RF433射頻模塊、GPRS通信模塊、北斗/GPS定位模塊、電池模塊和MSP430單片機(jī)模塊。聲光報(bào)警單元主要用于本地報(bào)警和狀態(tài)指示;電量檢測模塊對報(bào)警裝置的電池電量進(jìn)行檢測;充電保護(hù)模塊用于為電池充電,具有過充保護(hù);RF433射頻模塊用于檢測裝置與報(bào)警裝置的無線通信;GPRS通信模塊用于報(bào)警裝置與后臺服務(wù)器的數(shù)據(jù)通信;北斗/GPS定位模塊用于獲取報(bào)警裝置的位置數(shù)據(jù);電池模塊用于為報(bào)警裝置提供電能。報(bào)警裝置安裝有鋰電池,同時(shí)能夠進(jìn)行外部供電,其電池能夠保證報(bào)警裝置斷電后工作6 h。

2 結(jié)果

2.1 犬細(xì)小病毒檢測靶序列的確定

通過77個(gè)不同犬細(xì)小病毒全基因組的數(shù)據(jù)比對，從中找出一段433 bp的高度保守序列：

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量LAMP的靈敏度

為避免LAMP后進(jìn)行電泳容易導(dǎo)致的氣溶膠污染問題及離心看沉淀容易導(dǎo)致的誤判問題，特采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配合熒光染料Eva Green進(jìn)行實(shí)時(shí)定量LAMP和高分辨率熔解曲線分析。以1/10梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和水作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量犬細(xì)小病毒LAMP檢測。

用1×103、1×102、1×101拷貝/μL模板和空白對照進(jìn)行擴(kuò)增。從圖1可見，3個(gè)加水的空白對照孔無擴(kuò)增信號，1×103～1×101拷貝/μL 模板進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間在15 min以內(nèi)，而且反應(yīng)時(shí)間隨模板濃度降低依次遞增，符合模板濃度與擴(kuò)增速度的對應(yīng)規(guī)律。犬細(xì)小病毒LAMP檢測靈敏度低至101拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。圖2的HRM分析結(jié)果表明 LAMP 反應(yīng)的特異性很好，1×103～1×101拷貝/μL模板擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值都在同一個(gè)溫度區(qū)間，說明產(chǎn)物完全一致。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量LAMP檢測犬細(xì)小病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線

2.3 可視化LAMP擴(kuò)增的靈敏度

用pH敏感指示劑中性紅檢測LAMP，中性紅在擴(kuò)增反應(yīng)前pH8.0左右的反應(yīng)液中呈淡黃色，而LAMP后反應(yīng)液的pH值會下降到7.6以下，此時(shí)中性紅變?yōu)榈霞t色。

用1×103、1×102、1×101拷貝/μL模板和空白對照進(jìn)行擴(kuò)增。從圖3可見，反應(yīng)40 min時(shí)，3個(gè)濃度模板的擴(kuò)增反應(yīng)液均變成了淡紫紅色，而空白對照反應(yīng)仍為淡黃色。可視化LAMP擴(kuò)增靈敏度和實(shí)時(shí)熒光定量LAMP擴(kuò)增靈敏度相同。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量LAMP檢測犬細(xì)小病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線

2.4 可視化LAMP檢測方法的特異性

因犬細(xì)小病毒為DNA病毒，與RNA病毒的反應(yīng)體系差異較大，故特異性實(shí)驗(yàn)選用了金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)志賀菌、坂崎腸桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的DNA作為對照樣品。圖4可見，只有犬細(xì)小病毒發(fā)生了顏色變化，而其他DNA及水沒有擴(kuò)增信號，說明本檢測方法特異性強(qiáng)。

2.5 病毒樣本檢測和測序驗(yàn)證

用實(shí)時(shí)熒光定量LAMP和建立的可視化LAMP法檢測了50份疑似犬細(xì)小病毒DNA樣品。熒光檢測染料擴(kuò)增結(jié)果（圖5）表明其中35份樣品為犬細(xì)小病毒陽性，與圖6可視化檢測結(jié)果一致；HRM分析結(jié)果（圖7）表明陽性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值一致，且和圖2質(zhì)粒擴(kuò)增Tm值一致,說明反應(yīng)產(chǎn)物相同。

圖3 可視化LAMP檢測犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

圖8 為用國標(biāo)法檢測50個(gè)樣品DNA的電泳圖，擴(kuò)增長度為609 bp，檢測結(jié)果同可視化檢測與熒光檢測完全一致。用引物CPV-F3和CPVB3進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序（圖9），并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比對驗(yàn)證，結(jié)果表明陽性樣品含有犬細(xì)小病毒DNA序列，且15個(gè)LAMP檢測陰性樣品不含犬細(xì)小病毒序列，表明本方法和國標(biāo)檢測的符合度為100% 。

圖4 可視化LAMP檢測犬細(xì)小病毒方法特異性試驗(yàn)

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量LAMP檢測疑似犬細(xì)小病毒擴(kuò)增曲線

圖6 疑似犬細(xì)小病毒DNA的可視化LAMP檢測

圖7 疑似犬細(xì)小病毒樣品DNA的實(shí)時(shí)熒光定量LAMP熔解曲線

圖8 疑似犬細(xì)小病毒樣品DNA的國標(biāo)檢測結(jié)果

圖9 犬細(xì)小病毒可視化LAMP檢測陽性DNA樣品PCR產(chǎn)物測序圖譜

3 討論

我們建立了一種高效、準(zhǔn)確且方便的犬細(xì)小病毒檢測方法。該方法不需要昂貴復(fù)雜的儀器，一個(gè)金屬浴或水浴鍋即可進(jìn)行反應(yīng)；判斷結(jié)果不需要任何儀器，肉眼即可判斷陰性和陽性樣品。

pH值在擴(kuò)增前后的變化是本可視化檢測的基礎(chǔ)，因此本方法采用的擴(kuò)增體系是非緩沖體系，而非緩沖體系對引物的要求較高。我們共設(shè)計(jì)了6套擴(kuò)增引物，結(jié)果3套沒有擴(kuò)增信號，2套引物的擴(kuò)增效率低。擴(kuò)增超過80 min時(shí)，陰性對照也會出現(xiàn)顏色變化而影響對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，所以廣泛篩選引物是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。我們同時(shí)應(yīng)用了溴百里香酚藍(lán)和甲酚紅作為pH指示劑，均因顏色變化不明顯而放棄。

我們建立的方法操作簡單，無須專業(yè)訓(xùn)練即可使用；擴(kuò)增后無須開蓋，肉眼便可判定檢測結(jié)果，從而避免了產(chǎn)物污染的問題。本方法可用于虎與大熊貓的野外或基層犬細(xì)小病毒檢測，也可以用于寵物貓與狗的家庭化犬細(xì)小病毒檢測。用本方法可以開發(fā)多種細(xì)菌和病毒的檢測試劑盒，可有效提高對傳染病的防控能力。