張照研，王宇光，高月

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

細胞色素 P450 7A1（cytochrome P450 7A1，CYP7A1）是細胞色素P450超家族的一個亞型，也稱膽固醇7α-羥化酶，屬于氧化還原酶類[1]。CYP7A1能將膽固醇轉(zhuǎn)化為7α-羥基膽固醇，是膽汁酸合成中的第一步和限速步驟。內(nèi)源性膽固醇和膽汁酸水平可嚴格調(diào)控CYP7A1的基因表達，以維持上述2種成分的體內(nèi)水平[2-7]，在膽酸和膽固醇代謝中起重要作用。因此，深入研究對CYP7A1具有調(diào)控作用的藥物和天然產(chǎn)物，對以膽固醇和膽酸代謝為特征的相關(guān)疾病治療具有重要價值。本研究旨在構(gòu)建以CYP7A1基因啟動子為啟動序列的雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)，為進一步研究中藥及其成分對CYP7A1的調(diào)控機制提供有效篩選模型。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，由本實驗室凍存保種；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、DL2000和 DL10000 DNA marker、dNTP 混合物、10×緩沖液、ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒購于寶生物工程(大連)有限公司；LipofectAMINE 2000、TRIzol購于Invitrogen公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購于天根生物技術(shù)公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購于普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成；24孔細胞培養(yǎng)板購于Corning公司；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉等試劑購于Oxford公司；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶購于Sigma公司；青霉素鏈霉素雙抗溶液購于HyClone公司。

PCR儀、Victor X多標記酶標儀（Perkin Elmer公司）；電泳儀、電泳槽設(shè)備、成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；3110細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；Mi?crofuge 22R臺式高速離心機（Beckman公司)；Ax?iovert 40倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

1.2 報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 目的片段獲得 從L02細胞中提取基因組DNA。設(shè)計CYP7A1啟動子PCR擴增引物，并分別引入KpnⅠ、HindⅢ酶切位點，根據(jù)啟動子ATG上游2100 bp序列及載體的多克隆位點信息，分別設(shè)計上游引物（GCGGTACCCCATCAGATCTCA TGAAATT，添加KpnⅠ酶切位點）、下游引物（GG ATCCCATGCATGATGCACATGCTA，添加HindⅢ酶切位點），擴增的啟動子位置為-2058～+2。

1.2.2 CYP7A1啟動子PCR擴增 PCR采用20 μL反應(yīng)體系（反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，36個循環(huán)；72℃延伸 10 min）。取5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL 6×上樣緩沖液，用0.5% 的瓊脂糖凝膠電泳分析。將擴增產(chǎn)物回收純化，將擴增的啟動子片段插入pUC57，構(gòu)建pUC57-CYP7A1-promoter。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將pUC57-CYP7A1-promoter與pGL3-Basic載體雙酶切，將2質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物分別回收純化后得到已含有粘性末端的載體和插入片段，用T4DNA連接酶于16℃低溫恒溫反應(yīng)槽中連接16 h，得到重組質(zhì)粒。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)1 h后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，挑選陽性克隆擴增并提取重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，將重組質(zhì)粒進行雙向測序拼接確定堿基序列，并進行Blast比對。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和熒光值檢測

1.3.1 細胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)基由含10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基構(gòu)成，在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞，0.25% 胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 轉(zhuǎn)染和熒光檢測 采用轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectAMINE 2000進行。取對數(shù)生長期HepG2細胞，消化后計數(shù)，按每孔2.5×105細胞接種于24孔板中，當細胞密度達約80% 時用Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒。將500 ng pGL3-CYP7A1-promoterluc（采用測序無誤的質(zhì)粒2、3分別進行實驗）、50 ng pRL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒、2 μL LipofectAMINE 2000混勻；將500 ng pGL3-Basic、50 ng pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒、2 μL LipofectAMINE 2000混勻，設(shè)置為對照組；質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑室溫孵育20 min，24孔板每孔加入100 μL混合轉(zhuǎn)染液，在細胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h，吸去混合液，換含2% 胎牛血清、不含青霉素鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h，吸去各組培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞1次，每孔加入100 μL 1×PLB溶液，室溫靜止裂解15 min，加入100 μL LABⅡ溶液，多功能酶標儀檢測各孔的螢火蟲螢光素酶活性；接著各孔加入100 μL Stop＆Glo試劑，啟動海腎螢光素酶反應(yīng)后，檢測海腎螢光素酶活性，并計算熒光值比值。

圖1 CYP7A1啟動子擴增片段（2060 bp）凝膠電泳

圖2 pUC57-CYP7A1-promoter質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖3 pGL3-CYP7A1-promoter-luc構(gòu)建過程示意圖

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗處理，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP7A1啟動子擴增的凝膠電泳測定

結(jié)果見圖1。引物設(shè)計PCR的片段大小為2060 bp，PCR產(chǎn)物凝膠電泳顯示目的條帶約為2000 bp，與CYP7A1啟動子大小相符，表明成功擴增了CYP7A1的啟動子。對產(chǎn)物進行回收后再次PCR，膠回收產(chǎn)物。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

pGL3-CYP7A1-promoter-luc質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2、3所示。首先將克隆載體pUC57-vector與PCR擴增的CYP7A1啟動子連接。之后，將構(gòu)建的pUC57-CYP7A1-promoter與熒光載體pGL3-Basic vector用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ雙酶切（圖4），回收2060 bp的CYP7A1啟動子片段，與pGL3-Basic載體用T4DNA連接酶連接，連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑單克隆振蕩培養(yǎng)，進行菌液PCR驗證（圖5），經(jīng)氨芐青霉素篩選得到重組熒光質(zhì)粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc，測序。雙酶切pUC57-CYP7A1-promoter與熒光載體pGL3-Basic vector結(jié)果顯示片段大小符合預(yù)期。菌液PCR結(jié)果表明，除泳道5、11外，均鑒定為陽性克隆質(zhì)粒。測序比對發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pGL3-CYP7A1-promoter-luc中的測序片段與CYP7A1啟動子一致。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了熒光質(zhì)粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。

2.3 測序

構(gòu)建質(zhì)粒 pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3進行雙向測序，拼接后經(jīng)Blast比對，序列與CYP7A1啟動子相同，測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖6）。

2.4 細胞轉(zhuǎn)染和螢光素酶活性測定

分別將pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞，6 h后換含2% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后檢測熒光，計算熒光值比值，分別與對照組（pGL3-Basicvector）進行組間t檢測。轉(zhuǎn)染pGL3-CYP7A1-promoter-luc2質(zhì)粒24、48 h后，熒光響應(yīng)值分別為對照組的13.1±2.8倍（P＜0.001）和23.3±2.9倍（P＜0.001）；轉(zhuǎn)染 pGL3-CYP7A1-promoterluc3質(zhì)粒24、48 h后，熒光響應(yīng)值分別是對照組的8.4±1.6倍（P＜0.001）和22.1±1.9（P＜0.01）倍；結(jié)果均有顯著性差異（圖7），表明質(zhì)粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3均能響應(yīng)。

3 討論

圖4 pUC57-CYP7A1-promoter和pGL3-Basic vector的雙酶切

圖5 瓊脂糖凝膠檢測菌液PCR擴增片段

圖6 質(zhì)粒2測序示意圖（-20～175 bp）

圖7 螢光素酶活性測定

報告基因的表達產(chǎn)物為特定蛋白質(zhì)或酶，可被檢測和鑒定，從而間接反映基因調(diào)控的效率和特異性。報告基因在表達過程中對細胞或動物正常的生理作用或活性沒有影響。常用的報告基因有螢光素酶基因、綠色和紅色熒光蛋白基因等[8]。報告基因法在病毒檢測和抗病毒藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[9-11]。本實驗室前期曾構(gòu)建過CYP1A1、CYP2B6、CYP3A4等熒光報告基因載體，并對烏頭堿[12]、補骨脂[13]、人參皂苷[14]、麥冬皂苷[15]等成分進行篩選，發(fā)現(xiàn)了中藥的配伍以及中藥有效成分對藥物代謝酶的影響規(guī)律，為相關(guān)中藥的臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。筆者采用實驗室已構(gòu)建的CYP3A4啟動子的熒光報告基因質(zhì)粒對何首烏的成分進行篩選，發(fā)現(xiàn)其中成分具有上調(diào)和下調(diào)CYP3A4的作用，該研究為何首烏在臨床合理使用提供了實驗層面的參考[16-17]。

膽固醇7α-羥化酶是體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的經(jīng)典合成途徑的第一限速酶[18]，催化膽固醇為7α-羥化膽固醇。膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸是其代謝的主要途徑[19-20]。CYP7A1表達除受晝夜節(jié)律及基因多態(tài)性影響外，還可被激素、細胞因子等多種因素調(diào)控。其表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，受到包括 FXR、HFN-4α、SHP、SREBP-1C、PGC-1α等諸多核因子調(diào)控。中藥及其方劑對調(diào)脂和降低膽固醇具有較好的療效。近來有轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，何首烏通過上調(diào)膽固醇和膽酸生物合成的關(guān)鍵酶CYP7A1從而產(chǎn)生肝損傷[21]。相比于轉(zhuǎn)錄組學(xué)通量大耗時長，螢光素酶報告基因系統(tǒng)具有檢測速度快、靈敏度高、結(jié)果確切等優(yōu)點，在藥物篩選、疾病檢測等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。中藥方劑和有效成分能通過調(diào)控CYP7A1，調(diào)解體內(nèi)膽酸和膽固醇的穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮降脂治療膽結(jié)石等藥效[22-26]。探討中藥及其成分對CYP7A1的調(diào)控方式十分重要，構(gòu)建的CYP7A1啟動子螢光素酶報告基因載體為這一研究提供了新的工具。

綜上，我們構(gòu)建了CYP7A1啟動子螢光素酶報告基因載體，下一步將利用構(gòu)建的載體研究中藥成分對CYP7A1的調(diào)控，以期發(fā)現(xiàn)其對內(nèi)源性膽酸合成代謝的影響。