楊 波 ，羅 倩 ，靳亞軍 ，熊 煒 ，孔曉聰 ，王 荃 ，邳瑞雪 ，石雨鷺 ，欒維江

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

亮氨酸拉鏈蛋白（Homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，保守性較高，通常含有1個(gè)同源異型域（Homeodomain，HD），屬于同源異型域轉(zhuǎn)錄因子超家族.HD-Zip的異型域由60或61個(gè)保守氨基酸殘基組成，在空間上形成1個(gè)三股螺旋結(jié)構(gòu)，并被1個(gè)環(huán)和1個(gè)轉(zhuǎn)角分開(kāi).三股螺旋結(jié)構(gòu)與特異DNA分子的雙螺旋大溝相結(jié)合，擔(dān)任該轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程[1-2].根據(jù)結(jié)構(gòu)域的保守性、空間結(jié)構(gòu)的差異性、與DNA結(jié)合的特異性和生物學(xué)功能，可以將眾多的HD-Zip蛋白分為4個(gè)亞家族，即HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ[3].

HD-Zip家族基因的表達(dá)常受低溫、激素、光照、逆境等因素的誘導(dǎo)，主要參與光信號(hào)和激素信號(hào)的介導(dǎo)途徑，對(duì)植物胚胎形態(tài)發(fā)生、分生組織形成、側(cè)生器官發(fā)生和維管系統(tǒng)發(fā)育等多個(gè)過(guò)程都起到重要調(diào)控作用[4].HD-ZipⅢ家族主要參與調(diào)控植物胚胎形態(tài)發(fā)生、分生組織形成等過(guò)程.如擬南芥的基因組中含有5個(gè)HD-ZipⅢ基因，分別為PHB、PHV、REV、ATHB8及ATHB15.其中PHB、PHV和REV在功能上存在冗余，它們?cè)趥?cè)生分生組織以及花器官的分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還影響葉片的極性，當(dāng)REV的功能缺失時(shí)，植物形成畸形的葉和花器官，當(dāng)PHB和PHV過(guò)量表達(dá)時(shí)，植物的葉片沿近軸面生長(zhǎng)，最終也形成畸形葉；而ATHB8和ATHB15在功能上與PHB、PHV、和REV拮抗，能夠抑制rev、phv雙突變體植株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的缺陷[5].在陸生植物中HD-ZipⅢ家族成員是高度保守的，但是由于進(jìn)化，在不同的物種中，彼此同源的成員在功能上也已經(jīng)有所分化[6].

單子葉植物水稻（Oryza sativa）的HD-ZipⅢ亞家族中也存在 5個(gè)基因，分別為 OsHox9、OsHox10、OsHox29、OsHox32、OsHox33，目前對(duì)該家族的研究已取得一定進(jìn)展.Ai等[7]發(fā)現(xiàn)OsHox9的RNAi干擾植株表現(xiàn)出株高變矮、分蘗數(shù)減少的表型.Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)OsHox32會(huì)使植株產(chǎn)生向近軸面卷曲的窄葉，此外由于葉夾角減小導(dǎo)致株型直立，株高變矮.Itoh等[9]發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)microRNA166-resistance的OsHB3（即OsHox33），植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的缺陷，包括產(chǎn)生異位的葉緣、芽和輻射狀的葉片.Luan等[10]研究發(fā)現(xiàn)干擾OsHox33的表達(dá)能夠加速水稻葉片衰老.本研究采用反向遺傳學(xué)方法初步探索了水稻HD-ZipⅢ亞家族成員OsHox10的功能，明確了該基因的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位，并初步了解該成員與植物激素和干旱脅迫的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua 11）及其轉(zhuǎn)基因植株為實(shí)驗(yàn)材料.所有材料種植于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田和海南陵水南繁育種基地，田間保持常規(guī)管理.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Veriti 9902 PCR儀、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，美國(guó)ABI公司；凝膠成像分析儀，北京Bio-Rad公司；BG-Power 600電泳儀，美國(guó)Baygene公司；DM5000B正置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica公司.

1.2.2 試劑

PCR試劑、Real-time PCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶等，南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker，日本Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，北京康為世紀(jì)生物有限公司；引物合成及DNA測(cè)序由武漢金開(kāi)瑞生物科技有限公司完成.

1.3 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和水稻遺傳轉(zhuǎn)化

從生長(zhǎng)30d的水稻幼苗中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板擴(kuò)增OsHox10的全長(zhǎng)ORF，所用引物為：OsHox10-F（5′-TACggtaccATTTGGCTTTGGCGAGGTAG-3′）和 OsHox10-R（5′-TACgagctcTGGGATGGTCACACAAAGGA-3′）（小寫(xiě)字母為載體中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)）.將擴(kuò)增的片段酶切回收后，連入pUBI1460空載體中，獲得重組載體pUBI1460-OsHox10，通過(guò)酶切鑒定及測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入野生型中花11中，獲得過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株.

1.4 Real-time PCR分析

收集水稻新鮮的幼根、幼嫩葉片、莖頂端分生組織、成熟葉鞘及4～13 cm長(zhǎng)的幼穗，用Trizol試劑提取這些組織器官的總RNA.用DNase I去除基因組DNA污染后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為Realtime PCR反應(yīng)的模板，OsHox10表達(dá)檢測(cè)所用的引物為 OsHox10-F2（5′-AACTTCCCTTGTCGCCTTAC-3′）和OsHox10-R2（5′-GTGAACATTGCTATCCTCGG-3′），以O(shè)sActin1作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，引物為ActinF（5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′）和 ActinR（5′-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3′）.Real-time PCR 反應(yīng)按照 SYBR Green PCR master mix（Vazyme，南京）試劑盒說(shuō)明操作，在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次.

1.5 OsHox10的亞細(xì)胞定位

從生長(zhǎng)30 d的水稻幼苗中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板擴(kuò)增OsHox10的全長(zhǎng)ORF（去除終止密碼子）.所用引物為GFP-Hox10-F（5′-TCA-gagctcATTTGGCTTTGGCGAGGTAG-3′）和 GFP-Hox10-R（5′-TACgtcgacCACAAAGGACCAGTTGACGA-3′）.將擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)酶切回收后與空載體pCAMBIA35S：：GFP進(jìn)行連接，使OsHox10與GFP融合.測(cè)序鑒定正確后，分別將含有融合載體pCAMBIA35S：：OsHox10-GFP和空載體的農(nóng)桿菌注射進(jìn)煙草（Nicotiana tabacum）葉片，室溫下正常培養(yǎng)2 d后，在正置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況.

1.6 植物激素及干旱脅迫處理

激素處理中，分別用0.1 mmol/L的乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）、脫落酸（ABA）及茉莉酸（JA）處理生長(zhǎng)40 d的野生型水稻幼苗，然后在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)收集葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Realtime PCR分析.干旱脅迫處理中，水稻幼苗生長(zhǎng)于土培周轉(zhuǎn)箱中，排水后不再澆水，在處理0、2、3、4、5、7 d后分別取樣，提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 HD-ZipⅢ家族成員序列分析

分析植物HD-ZipⅢ家族成員的序列，結(jié)果如圖1所示.

HD-Zip家族成員都含有同源異型結(jié)構(gòu)域HD和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域 LZ（Leucine-zipper domain）[7]，HD區(qū)域是由60或61個(gè)保守氨基酸構(gòu)成的，在空間上形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別靶基因啟動(dòng)子5′上游區(qū)的特定核苷酸序列，LZ區(qū)位于HD區(qū)的羧基端，是1個(gè)一側(cè)富含疏水氨基酸的雙ɑ螺旋，在該區(qū)域中每隔7個(gè)氨基酸就分布著1個(gè)亮氨酸殘基，在ɑ螺旋的疏水表面排成一條直線.HD-ZipⅢ家族的成員除了含有HD及LZ保守結(jié)構(gòu)域外，還包含2個(gè)附加結(jié)構(gòu)域（START和 MEKHLA）（圖1a）.START是類固醇敏感的脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域，MEKHLA可能與植物接收光信號(hào)調(diào)控有關(guān)[8].

為了比較不同植物HD-ZipⅢ家族成員間的差異，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了6種不同植物的HD-ZipⅢ家族蛋白質(zhì)序列信息.小立碗蘚（Physcomitrella patens）：PpHB11（ABG73236）、PpHB12（ABG73237）、PpHB13（ABG73238）、PpHB14（ABG73239）；白云杉（Piceaglauca）：PgHB3（ADV04322）、PgHB4（ADV04323）、PgHB5（ADV04324）、PgHB6（ADV04325）；擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）：REV（AED97367）、PHV（O04292）、PHB（AEC09012）、 AtHB15（AEE32762）、AtHB8（AEE86138）；水稻（Oryza sativa）：OsHox10（A2XBL9）、OsHox9（A2Z8L4）、OsHox32（A2XK30）、OsHox33（A2ZMN9）；毛果楊（Populus trichocarpa）：PtrHB1（AAX19050）、PtrHB2（AAX19051）、PtrHB3（AAX19052）、PtrHB4（AAX19053）、PtrHB5（AAX19054）、PtrHB6（AAX19055）、PtrHB7（AAX19056）、PtrHB8（AAX19057）；玉米（Zea mays）：rld1（NP_001296150）、rld2（XP_0086 65074）.聚類分析發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)發(fā)育中，OsHox9和OsHox10在結(jié)構(gòu)上更相似，而OsHox32和OsHox33相似（圖1b、1c），因此它們?cè)诠δ苌峡赡苡腥哂?在植物演化上，OsHox9和OsHox10與玉米的rld1和rld2關(guān)系更近，OsHox32和OsHox33則與擬南芥的PHB和PHV關(guān)系更近.它們和毛果楊及小立碗蘚關(guān)系較遠(yuǎn)，小立碗蘚中的HD-ZipⅢ成員自成一類.表明HD-ZipⅢ成員在植物進(jìn)化過(guò)程中已有了一定的分化.

2.2 OsHox10的表達(dá)特異性分析

為了研究OsHox10在水稻不同組織中的表達(dá)情況，分別提取野生型水稻不同組織器官的總RNA，用Realtime-PCR的方法檢測(cè)OsHox10的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示.

圖2 OsHox10的組織特異性表達(dá)分析Fig.2 Tissue-specific expression analysis of OsHox10

由圖2可以看出，OsHox10在不同組織器官中均有表達(dá)，在莖頂端分生組織（YM）和幼穗（P3、P2、P1）中表達(dá)量較高，在根、莖、葉及葉鞘中表達(dá)較低，表明OsHox10在分裂旺盛部位有較高表達(dá).

2.3 植物激素及干旱脅迫處理對(duì)OsHox10表達(dá)的影響

分別用ACC、ABA和JA處理同一時(shí)期的野生型水稻，取樣后，用Realtime-PCR分析OsHox10的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示.

圖3 激素和干旱脅迫對(duì)OsHox10表達(dá)的影響Fig.3 Expression of OsHox10 under the treatment of phytohormones and drought stress

由圖3可以看出，3種激素處理后，OsHox10的表達(dá)量較野生型相比都有所升高.ACC處理2 h后，OsHox10的表達(dá)量達(dá)到峰值，之后又下降；JA處理12h后，OsHox10的表達(dá)量是對(duì)照的3倍；ABA處理4 h后，OsHox10的表達(dá)量達(dá)到峰值.另外，分析干旱脅迫處理下OsHox10的表達(dá)，結(jié)果表明處理的前3 d對(duì)OsHox10的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，處理4 d之后，表達(dá)量明顯上升，表明干旱脅迫誘導(dǎo)了OsHox10的表達(dá)（圖3d）.因此，推測(cè)OsHox10可能與外界不良環(huán)境刺激及激素信號(hào)有關(guān).

2.4 OsHox10的亞細(xì)胞定位

為了進(jìn)一步明確OsHox10的表達(dá)模式，構(gòu)建目的基因與GFP蛋白融合的表達(dá)載體（p35S：：OsHox10-GFP），對(duì)目的基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，以確定OsHox10轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中存在或發(fā)揮作用的位置.分別將含有目的基因的融合表達(dá)載體和空質(zhì)粒載體在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果如圖4所示.

圖4 OsHox10的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of OsHox10

由圖4可以看出，OsHox10-GFP融合蛋白在細(xì)胞周邊有強(qiáng)烈表達(dá).在成熟的植物表皮細(xì)胞中，由于液泡的存在，細(xì)胞質(zhì)主要存在于細(xì)胞周邊，因此OsHox10可能定位于細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞質(zhì)膜上.空載體對(duì)照中，整個(gè)細(xì)胞中（如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)）都能檢測(cè)到強(qiáng)烈的熒光，沒(méi)有特異性定位.

2.5 OsHox10過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型分析

為了揭示OsHox10在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，構(gòu)建了1個(gè)OsHox10的過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入野生型水稻的愈傷組織中，再經(jīng)過(guò)分化獲得轉(zhuǎn)基因幼苗，最終獲得了7個(gè)獨(dú)立株系的T0代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，共計(jì)73株.用載體中特異的NPTII基因引物對(duì)T0代植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5（a）所示.過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中有51株（5個(gè)株系）為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，陽(yáng)性率約為70%.種植3個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性獨(dú)立株系及對(duì)照，獲得T1代植株，Real-time PCR分析表明轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系中OsHox10明顯過(guò)量表達(dá)，如圖5（d）所示.觀察田間表型發(fā)現(xiàn)，每個(gè)株系的過(guò)表達(dá)植株葉片表現(xiàn)出不同程度的皺縮、卷曲，尤其是靠近葉鞘部分卷曲明顯呈鋸齒狀，如圖5（b）和5（c）所示，表明過(guò)量表達(dá)OsHox10會(huì)影響水稻葉片的發(fā)育及株型建成.

圖5 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型Fig.5 Phenotype of overexpressing transgenic plants

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)反向遺傳學(xué)方法對(duì)水稻HD-ZipⅢ家族成員OsHox10的功能進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)OsHox10能使水稻葉片形態(tài)異常，表明其對(duì)水稻株型建成具有重要作用.在擬南芥中，HD-ZipⅢ家族基因PHB、PHV和REV在功能上存在冗余，影響葉片極性，當(dāng)REV的功能缺失時(shí)，植物形成畸形葉，當(dāng)PHB和PHV過(guò)量表達(dá)時(shí)，植物的葉片沿近軸面生長(zhǎng)，最終也形成畸形葉[5].在水稻中，Itoh等[9]發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)HD-ZipⅢ家族基因 OsHB3、OsHB5（OsHox33）、OsHox29 會(huì)導(dǎo)致葉片畸形，形成卷葉或絲狀葉；Li等[8]在對(duì)OsHox32的研究中也發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)該基因會(huì)導(dǎo)致形成狹窄卷曲的畸形葉.這些研究與過(guò)量表達(dá)OsHox10的結(jié)果相互印證，表明水稻HD-ZipⅢ家族基因功能相對(duì)保守但又不盡相同.此外，組織特異性分析顯示，OsHox10在分裂旺盛的部位表達(dá)量較高，表明其可能與器官發(fā)生分化有關(guān)，這與HD-ZipⅢ家族參與分生組織形成、側(cè)生器官發(fā)生等多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的情況相吻合.

擬南芥HD-ZipⅢ的一個(gè)成員AtHB8的轉(zhuǎn)錄受生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)[11].Itoh等[9]發(fā)現(xiàn)，給水稻施加外源生長(zhǎng)素能導(dǎo)致HD-ZipⅢ家族基因的表達(dá)量上升.此外，有研究[3]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫和外源施加脫落酸（ABA）也能誘導(dǎo)擬南芥HD-Zip家族基因ATHB6、ATHB7和ATHB12的表達(dá).本研究結(jié)果表明植物激素及干旱脅迫能誘導(dǎo)OsHox10的表達(dá)，說(shuō)明OsHox10可能與逆境脅迫和激素相關(guān).

細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)的N端有特殊的核定位信號(hào)（Nuclear localization signal，NLS），能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，一般NLS是由8～10個(gè)富含精氨酸、賴氨酸及脯氨酸等帶正電荷的氨基酸殘基組成，以短肽的形式存在于N端，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子具有NLS，定位于細(xì)胞核中，但不是所有的轉(zhuǎn)錄因子都如此[12].在小麥NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族中，TaNTL1與GFP融合蛋白就定位在細(xì)胞膜上，當(dāng)TaNTL1的跨膜域缺失后會(huì)特異地定位在細(xì)胞核中，因此TaNTL1是作為跨膜轉(zhuǎn)錄因子行使功能的，此外還發(fā)現(xiàn)TaNTL2和TaNTL3也是跨膜轉(zhuǎn)錄因子[13].本研究結(jié)果表明，OsHox10定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，分析其N端可能是核定位信號(hào)的氨基酸序列，但N端NLS的特點(diǎn)不明顯，結(jié)合定位結(jié)果，推測(cè)它可能是具有細(xì)胞質(zhì)特性的轉(zhuǎn)錄因子.OsHox10的精確功能還有待進(jìn)行更深入細(xì)致的研究.