馮高華 劉美秀 惠曉丹 劉 臻 朱曉舟 朱 虹

（1.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇張家港215600； 2.揚州大學醫(yī)學院，江蘇揚州225000）

支氣管哮喘（哮喘）是由多種炎性細胞和炎性介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。調(diào)查顯示，目前全球哮喘人數(shù)已超過5%，且患病率與病死率均有持續(xù)上升的趨勢，嚴重影響患者的身心健康[1]。吸入性皮質(zhì)類固醇激素和β-2激動劑常作為哮喘患者的一線治療藥物[2]，但存在價格較高、治療周期長、副作用明顯或停藥后癥狀加重等問題[3]。平喘湯為臨床經(jīng)驗方，是以三子養(yǎng)親湯為基礎，配合宣肺、平喘等藥物加減而成。既往的臨床研究表明，本方可以改善支氣管哮喘患者急性發(fā)作期的肺功能[4]。本實驗通過研究平喘湯對哮喘大鼠嗜酸性粒細胞（EOS）凋亡及Bax蛋白表達的影響，探索本方防治哮喘的機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康SPF級SD大鼠72只，雌雄各半，6～8周齡，體重（196.6±11.2）g，無雞卵清蛋白飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度21～25℃，濕度52.1%～64.2%，飼養(yǎng)于揚州大學實驗動物中心。實驗大鼠購買于南通大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK（蘇）2014-0001。

1.2 藥品 平喘湯由炙麻黃10g，杏仁10g，葶藶子10g，蘇子10g，萊菔子15g，白芥子10g，枳殼10g，桔梗6g，地龍30g，僵蠶10g，五味子6g組成。中藥飲片由張家港市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)中藥制劑室制成滅菌濃煎密封制劑，置于250mL鹽水瓶中，4℃保存?zhèn)溆?。地塞米松片?.75mg/片，辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H37021969）以生理鹽水溶解備用。

1.3 試劑與儀器 TUNEL凋亡試劑盒，美國羅氏，POD貨號：11684817910；雞卵清蛋白（OVA），美國Sigma公司；氫氧化鋁凝膠，遂成藥業(yè)股份有限公司；IL-5 ELISA試劑盒，MSK公司，批號：KT30409；Anti-Bax Antibody，武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA315；HRP標記的羊抗兔（Bio-world公司）；切片石蠟，上海信然生化試劑有限公司；伊紅染液，武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素染液、中性樹膠，凱基生物公司。

超凈工作臺，蘇州蘇凈集團安泰公司；電子天平，上海第二天平儀器廠；顯微鏡NikonEclipse E200，日本尼康公司；黏附載玻片，江蘇恒泰實驗器材有限公司；推拉式石蠟切片機，德國萊卡公司；超聲霧化器，403C型，YZB/蘇0024-2012；光學顯微鏡，日本，OLYMPUS；全自動酶標儀，680型，美國BIO-RAD。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 隨機將實驗動物分為6組，每組12只，分別為模型組、正常組、地塞米松組和平喘湯低、中、高劑量組，每組編號后單籠飼養(yǎng)。除正常組外，其余各組大鼠均采用OVA制備哮喘模型。分別于致敏過程的第0、7、14天腹腔注射含有20μg OVA和20mg氫氧化鋁凝膠的0.9%氯化鈉混合液共200μL進行致敏[5]，正常組腹腔注射相同體積蒸餾水。哮喘組和治療組從第21天開始每日給予霧化吸入5% OVA激發(fā)液誘發(fā)哮喘，持續(xù)7d，每日1次，每次持續(xù)約0.5h，正常組行霧化吸入0.9%NaCl。造模大鼠出現(xiàn)抖毛、前肢撓鼻，同時有點頭呼吸、呼吸急促及站立不穩(wěn)、腹肌抽搐等癥狀，提示哮喘大鼠造模成功。

2.2 干預處理 各治療組均從第1次哮喘激發(fā)開始（造模第21天）每日霧化后予灌胃給藥：平喘湯低、中、高劑量組分別給予相當于生藥量4.8g/kg、9.6g/kg、19.2g/kg的藥液，地塞米松組給予地塞米松0.001g/kg，正常組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14d。末次給藥24h后，頸椎脫位法處死大鼠，打開胸腹腔，于無菌條件下取出肺組織，肉眼觀察其外觀，沿矢狀面切開成兩片，用預冷的無菌PBS液沖洗，除去血液，濾紙拭干，取一半肺組織放在10%福爾馬林中固定，制備厚度為0.3cm左右的標本，組織固定時間為24h以內(nèi)，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，以便進行病理組織學分析。

2.3 指標觀察

2.3.1 各組大鼠一般情況 造模前后及末次給藥結束后，分別觀察各組大鼠一般情況，包括精神、食欲、體重、大便及行為改變等情況。

2.3.2 肺組織病理形態(tài)學觀察 肺組織經(jīng)切片后，進行HE染色，封片后于光鏡下觀察病理形態(tài)，并以吸光度（OD）值進行定量分析。

2.3.3 肺組織EOS原位表達檢測 肺組織經(jīng)切片后，用DNA斷裂的原位末端標記法（TUNEL）檢測EOS表達，檢測方法按試劑盒中提供的操作說明嚴格進行。封片后于光鏡下觀察EOS表達情況，并以OD值進行定量分析。

2.3.4 肺組織Bax蛋白表達檢測 肺組織經(jīng)切片后，用免疫組化法檢測Bax蛋白表達，檢測方法按試劑盒中提供的操作說明嚴格進行。封片后于光鏡下觀察Bax蛋白表達情況，并以OD值進行定量分析。

2.4 統(tǒng)計學分析 利用GraphPad Prism5軟件包及SPSS 16.0系統(tǒng)軟件分析數(shù)據(jù)，結果以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05可認為有統(tǒng)計學差異。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠行為觀察 正常組大鼠呼吸正常，體溫恒定，毛發(fā)光澤、緊貼皮膚，眼睛明亮，鼻、唇部濕潤清潔，行動敏捷，大便正常。模型組及各治療組大鼠經(jīng)激發(fā)后行為改變明顯，表現(xiàn)為精神差、煩躁不安、抖毛、前肢撓鼻，同時有點頭呼吸、呼吸急促及站立不穩(wěn)、腹肌抽搐、二便失禁等。經(jīng)藥物干預后，各治療組大鼠上述癥狀較模型組均有不同程度減輕。

3.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)比較 正常組大鼠肺組織幾乎無炎性細胞浸潤，氣道黏膜上皮完整，肺泡結構未見明顯異常。模型組細支氣管管腔狹窄，管壁內(nèi)有嗜酸粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞浸潤，紅細胞和黏液在肺泡腔中均可見。各治療組大鼠病理程度較模型組均有不同程度改善，其中地塞米松組和平喘湯高、中劑量組大鼠氣道結構損傷明顯恢復，支氣管管壁厚度、肺組織炎性細胞浸潤等病理較模型組明顯減輕，見圖1。

3.3 各組大鼠EOS原位表達、Bax蛋白表達比較 TUNEL法細胞檢測結果顯示，正常組大鼠肺組織固有細胞胞漿中可見EOS表達的

陽性顆粒表達量極少，接近無；模型組EOS表達量明顯增多，呈強陽性表達，著色極深（棕黃色顆粒）；各治療組EOS在上述部位表達較模型組均有不同程度下調(diào)，但仍高于正常組。見圖2。免疫組化顯示，正常組大鼠肺組織固有細胞胞漿中可見Bax蛋白表達的陽性顆粒表達量極多，呈強陽性，著色極深（棕黃色顆粒）；模型組Bax蛋白表達量明顯減少；各治療組Bax蛋白在上述部位表達較模型組均有不同程度上調(diào)，但輕于正常組大鼠。見圖3。各組大鼠肺組織EOS原位表達、Bax蛋白表達OD值比較見表1。

4 討論

哮喘是由多種炎性細胞和炎性介質(zhì)共同參與并相互作用而導致的氣道慢性炎癥性疾病。氣道炎癥是哮喘的本質(zhì)，是哮喘氣道高反應性和反復發(fā)作的重要原因之一。為了評估平喘湯的抗炎作用，本課題組用光學顯微鏡檢查了哮喘大鼠肺組織標本。HE染色結果顯示，正常組大鼠肺組織無或者極少有炎癥，OVA誘導的哮喘模型大鼠肺組織HE染色顯示強陽性，即肺組織中存在廣泛的炎癥以及嚴重的支氣管痙攣、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤，另外紅細胞和黏液在肺泡腔中均可見。經(jīng)平喘湯干預后，各劑量組大鼠肺組織炎癥較模型組均有不同程度的改善，肺泡毛細血管中炎性細胞浸潤和紅細胞及分泌物均有不同程度的減少，以平喘湯高劑量組尤為明顯，其治療效果與地塞米松相當，而平喘湯中、低劑量療效遜于高劑量及地塞米松。本實驗組織學結果表明，足劑量的平喘湯療效近似于西藥地塞米松，具備一定的抗炎、降低氣道高反應的作用。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)（HE，40×）

表1 各組大鼠肺組織EOS原位表達、Bax蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織EOS原位表達、Bax蛋白表達比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與哮喘模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只）劑量（g/kg） EOS（OD值） Bax（OD值）正常組 8 9.6 5837.7±708.2## 40690.1±2520.7##模型組 8 9.6 30213.4±1203.8** 3051.7±250.7**地塞米松組 8 1×10-3 10253.9±643.0*## 19669.9±691.3**##平喘湯高劑量組 8 19.2 19670.0±1345.6**## 7013.9±574.5**##平喘湯中劑量組 8 9.6 23389.8±1206.8**#△ 5352.8±852.7**#△平喘湯低劑量組 8 4.8 24306.0±1016.3**#△ 4944.1±135.4**#△

圖2 TUNEL法測定各組大鼠肺組織EOS原位表達（40×）

一般認為，EOS是哮喘患者肺組織中主要參與炎癥反應的細胞[6]，且EOS在氣道的浸潤程度與哮喘病情的嚴重程度相關，因此，減少肺內(nèi)嗜酸粒細胞浸潤及促進嗜酸粒細胞凋亡是緩解支氣管哮喘氣道炎癥的重要方式[7]。本實驗結果顯示，模型組大鼠肺組織中EOS浸潤明顯高于正常組（P＜0.01）；各治療組EOS浸潤均明顯低于模型組（P＜0.01，P＜0.05），尤以地塞米松及中藥高劑量組效果更為明顯，提示減少炎癥反應中EOS的浸潤能緩解炎癥反應。哮喘發(fā)作時存在EOS凋亡受抑或EOS凋亡缺陷。細胞凋亡是多方面調(diào)控機制的共同結果，若干基因以及細胞因子有著重要的調(diào)控作用。其中Bax是Bcl-2家族中促進細胞凋亡的一個重要成員，當Bax大量表達時，細胞出現(xiàn)凋亡增多。EOS的凋亡是由Bax解聚并從胞核或胞質(zhì)中移至線粒體，線粒體隨后釋放細胞色素（cytochrome）C，擾亂線粒體膜電位，從而激活半胱天冬酶（caspase），導致EOS凋亡[8]。本實驗結果顯示，模型組大鼠肺組織中Bax蛋白表達明顯下調(diào)，各治療組Bax蛋白表達明顯高于模型組，且以平喘湯高劑量和地塞米松改善作用更為明顯。

圖3 免疫組化法檢測大鼠肺組織Bax蛋白表達（40×）

一般而言，地塞米松所代表的糖皮質(zhì)激素可直接或間接作用于哮喘發(fā)病的多個環(huán)節(jié)，發(fā)揮抗炎抗過敏作用，從而改善哮喘發(fā)作的癥狀[9]。本實驗結果推測，平喘湯可能通過上調(diào)Bax蛋白表達，誘導EOS凋亡，從而發(fā)揮抗炎平喘的作用，其高劑量的平喘效果近似于地塞米松，而低、中劑量的平喘效果顯著低于地塞米松，這可能與中藥的劑量過小及（或）量效關系未達到最大效應有關?？梢姡酱瓬軠p輕哮喘模型大鼠氣道高反應性，改善肺部病理學，其足劑量的藥效可能相當于治療氣道炎性疾病的抗炎劑，其基于分子水平的作用機制尚需進一步研究。