楊汝男,李燕清,陳 韜

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

我國豬肉產(chǎn)量和豬肉消費量均居世界首位[1],目前市場上銷售的豬肉主要分為熱鮮肉,冷鮮肉和冷凍肉。相較于熱鮮肉和冷凍肉,冷鮮肉在營養(yǎng)價值、口味、外觀包裝和食品衛(wèi)生等方面都更有優(yōu)勢[2]。冷鮮肉的食用質(zhì)量指標(biāo)主要包括滋味、質(zhì)地、多汁性和氣味等,其中持水性(WHC)是評價鮮肉與肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,持水性的大小經(jīng)常用汁液流失率來描述[3],它直接關(guān)系到冷鮮肉的成品率,嫩度和風(fēng)味[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),肌肉骨架蛋白的降解對汁液流失率和冷鮮肉的嫩度也有重要影響[5-6]。

踝蛋白(分子量225 kDa)是一種重要的肌肉細(xì)胞骨架蛋白質(zhì),踝蛋白作為細(xì)胞骨架肌動蛋白結(jié)合蛋白，在膜蛋白與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的偶連及信號通路中起到了非常重要的作用[7]。Koohmaraie等[8]研究發(fā)現(xiàn)，肉品成熟嫩化的主要原因是肌原纖維蛋白質(zhì)的變化和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的消失。這些變化包括組成細(xì)胞膜骨架的蛋白質(zhì)踝蛋白以及肌原纖維中高分子量蛋白質(zhì)肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白等的降解。Kristensen等[9]和Melody等[10]研究發(fā)現(xiàn)，踝蛋白(talin)宰后第一天開始降解,最早可在宰后24～48 h觀測到。Kristensen等[11]發(fā)現(xiàn)宰后成熟過程中,踝蛋白發(fā)生快速降解,使骨骼肌膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,使肌纖維收縮時產(chǎn)生的交聯(lián)及肌原纖維之間的交聯(lián)斷裂,擠壓細(xì)胞內(nèi)水分的力被消除,使肌肉的持水能力提高,因此推測持水性的增加是骨架蛋白質(zhì)的降解使肌細(xì)胞橫向膨脹的結(jié)果。Huff-Lonergan等[11]研究發(fā)現(xiàn),踝蛋白的降解能減少肌肉的汁液流失率。但Sch?fer等[12]在研究宰后3～24 h踝蛋白的變化與汁液流失的關(guān)系時,觀察到在宰后早期踝蛋白的降解與汁液流失無關(guān)?？梢?宰后豬肌肉踝蛋白的降解與持水性的關(guān)系還存在爭議。

因此，本文利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對宰后豬肉正常肉與PSE肉的踝蛋白變化與持水性的關(guān)系進(jìn)行研究,旨在探索影響肉持水性的內(nèi)在因素,對揭示冷卻肉的汁液流失形成機理具有重要的理論和學(xué)術(shù)價值,對指導(dǎo)我國迅速發(fā)展的冷卻肉生產(chǎn),具有重要經(jīng)濟(jì)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大河烏豬 云南東恒集團(tuán);甲醇 洛陽市化學(xué)試劑廠;冰醋酸 廣東汕頭西隴化工廠;氯化鈉 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;氯化鉀 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;鹽酸 北京化工廠;磷酸氫二鈉 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;磷酸二氫鉀 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;結(jié)晶牛血清蛋白 Sigma公司;二巰基乙醇Amresco公司;SDS十二烷基磺酸鈉 Amresco公司;Tris-堿 Amresco公司;甲叉雙丙烯酰胺 Amresco公司;過硫酸胺(APS)Amresco公司;甘氨酸 上海生工;甘油 Amresco公司;TEMED Amresco公司;以上試劑均為分析純;丙烯酰胺 超級純,Amresco公司。

HC-3018R臺式高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;HI9025C便攜式pH計 意大利哈納;CR-400/410色差儀 日本美能達(dá);T25-Basc高速勻漿機 德國IKA;BioRadPowerPac通用電泳儀電源 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;BioRad小型垂直電泳系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;BioRad槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;凝膠掃描儀 精工愛普生公司;全自動酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司;HH-6恒溫水浴鍋 常州市華普達(dá)教學(xué)有限公司;CP-先行者電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;XW-80A漩渦混合器 云南科儀化玻有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 選擇飼養(yǎng)條件相同的40只平均重量大約為140 kg的大河烏豬，在屠宰場中進(jìn)行屠宰,屠宰后獲得40條背最長肌,將背最長肌切分成20 cm×15 cm×10 cm的肉樣作為測定樣品。從中選取10個看起來可能為正常肉樣(RFN)和10個最可能為PSE肉樣,測定汁液流失率后依據(jù)Warner等[13]的標(biāo)準(zhǔn)(PSE肉:L*>50,汁液流失率>5%,pH<6.0 RFN肉L*=42～50,汁液流失率<5%,pH<6.0)得到15個RFN肉樣和5個PSE肉樣。

1.2.2 肉色的測定 取宰后45 min和0～4 ℃冷藏24 h的RFN和PSE肉樣測定肉色,測定時取背最長肌肉樣,然后切成體積為8 cm3的肉塊,將肉樣新切的一面在空氣中暴露10 min后,用便攜式色差儀測定L*值、a*值和b*值。每一肉樣測定三次,取平均值作為該肉樣的L*值、a*值和b*值。

1.2.3 pH和溫度的測定 取宰后各時間點(45 min、3、9、12、24 h)的RFN和PSE背最長肌肉樣用便捷式pH計測定pH和溫度,將探頭插入肉樣中,使pH計電極與肌肉組織充分接觸,待pH計穩(wěn)定后記錄pH和溫度。

1.2.4 汁液流失率(drop loss rate)的測定 采用Honikel法[14],取宰后24 h的背最長肌肉樣,然后切成體積為8cm3的肉塊稱重W1,置于保鮮袋中,沖氣(肉樣不能和保鮮袋接觸),在4 ℃下掉掛24 h,取出稱重W2,兩次重量之差除以初重W1的百分?jǐn)?shù)即為汁液流失率。

1.2.5 踝蛋白的降解

1.2.5.1 SDS-PAGE電泳蛋白樣品的提取 SDS-PAGE電泳蛋白樣品的提取采用全肌肉蛋白提取的方法,參照Huff-Lonergan等[15]的方法。稱取0.8 g切碎的背最長肌肉樣,加入10 mL的全肌肉蛋白提取液(10 mmol/L磷酸鈉,pH7.0,2%(w/v)SDS),勻漿(6500 r/min,4 ℃,30 s),在20 ℃下離心15 min(1500 g),取上清液,用BCA法測蛋白上清液濃度。上清液蛋白均用雙蒸水調(diào)節(jié)蛋白濃度至6.4 mg/mL。

取1 mL調(diào)整好濃度的蛋白上清液與0.5 mL樣品緩沖液(30 mmol/L Tris-HC1,3 mmol/L EDTA,3% SDS溶液,30%甘油,0.002%溴酚藍(lán)(0.003%焦寧),pH8.0)混合并加入0.1 mL 2-巰基乙醇,置于50 ℃水浴加熱20 min,冷卻至室溫后放入-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.5.2 踝蛋白的SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)印跡 參照Bee等[16]方法,制膠厚度0.75 mm,分離膠濃度為6%,濃縮膠濃度為5%。從左至右依次加入預(yù)染Mark 5 μL、參比蛋白樣品(選用宰后45 min,汁液流失率最小的12號正常肉樣,汁液流失率=0.96%)和宰后各時間點(45 min、3、9、12、24 h)蛋白樣品上樣量均為25 μg。樣品通過濃縮膠時設(shè)定電壓60 V,待樣品進(jìn)去分離膠后調(diào)整電壓到120 V。

SDS-PAGE電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)模,轉(zhuǎn)模條件為電壓90 V,時間1 h。待轉(zhuǎn)模結(jié)束后,取出PVDF膜，將其放于5%的脫脂奶粉中封閉2 h，結(jié)束后進(jìn)行一抗的孵育,孵育條件為4 ℃過夜,結(jié)束后取出PVDF膜,在室溫下進(jìn)行洗膜,洗膜條件為使用TBST在搖床上洗膜三次,每次時間10 min。結(jié)束后,進(jìn)行二抗孵育,孵育條件為室溫下孵育1 h。孵育結(jié)束后,進(jìn)行洗膜(TBST洗三次,每次時間10 min),將洗凈后的膜經(jīng)辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影,并于暗室中曝光。試驗過程中,選用的一抗為鼠抗(Anti-talin antibody produced in mouse,clone 8D4),稀釋比例為1∶200,二抗為抗鼠(HRP-Goat anti-Mouse IgG(H+L),SA00001-1),稀釋比例為1∶8000。

1.2.5.3 目標(biāo)蛋白定量 曝光后的膠片經(jīng)EPSON凝膠掃描儀掃描,用Image-Pro Plus軟件分析宰后45 min、3、9、12與24 h目標(biāo)蛋白光密度值,參比蛋白光密度值。目標(biāo)蛋白的光密度值與參比蛋白光密度值的比值作為該目標(biāo)蛋白的相對光密度值,用以表示目標(biāo)蛋白的降解程度,目標(biāo)蛋白的相對光密度值越低則表示蛋白的降解度就越高,反之亦然。每張膠片重復(fù)定量三次求平均值,以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

1.2.6 宰后pH、溫度、踝蛋白相對光密度值與汁液流失率的相關(guān)性 對宰后各時間點(45 min、3、9、12與24 h)RFN肉樣與PSE肉樣的pH、溫度、踝蛋白的相對光密度值與宰后24 h兩種肉樣的汁液流失率進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.7 宰后pH、溫度與踝蛋白相對光密度值的相關(guān)性 選用20個肉樣(包括15個RFN和5個PSE)，對宰后各時間點(45 min、3、9、12與24 h)RFN肉樣與PSE肉樣的pH、溫度與宰后各時間點(45 min、3、9、12與24 h)兩種肉樣踝蛋白的相對光密度值進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2007計算數(shù)值;Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行圖片分析;SPSS 18.0軟件進(jìn)行獨立樣品t檢驗和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后肉色的變化

宰后45 min和24 h兩組肉樣肉色指標(biāo)如表1所示,宰后45 min與24 h時,正常肉的L*、a*、b*值均低于PSE肉。其中PSE組的L*顯著高于正常組(p<0.05)。

表1 宰后肉色的指標(biāo)Table 1 Meat coloring of pork during postmortem

豬肉的色澤主要是受肌紅蛋白的數(shù)量及存在狀態(tài)、光線反射、水分、氧化程度等因素的影響[17]。根據(jù)肉色不僅可以鑒別肉的新鮮度,還可以辨別PSE肉、DFD肉等劣質(zhì)肉。PSE肉顏色蒼白,一方面由于肌紅蛋白含量相對較低,另一方面與肌紅蛋白的化學(xué)變化有關(guān)。pH下降的速度和程度對肉色有一定的影響。肌肉pH下降過快可能會造成包括肌紅蛋白在內(nèi)的肌漿蛋白在高溫、低pH條件下發(fā)生變性,肌肉的持水性降低、肉色灰白,即產(chǎn)生PSE肉[18-19]。

2.2 宰后肌肉pH的變化

宰后兩種肉樣的pH變化如圖1所示,在宰后45 min和3 h,正常肉的pH顯著高于PSE肉(p<0.05),而在之后的測定時間點(9、12、24 h)，兩種肉樣的pH無顯著差異(p>0.05)。正常肉在宰后9 h內(nèi)pH快速下降,以后下降速度變緩。宰后9～12 h之間,PSE肉的pH幾乎不下降,12 h之后pH顯著下降(p<0.05)。

圖1 宰后肌肉pH的變化Fig.1 Changes of pH during postmortem注:a、b、c、d表示同組內(nèi)含相同字母差異不顯著(p>0.05),含不同字母差異顯著(p<0.05);*表示不同組間同一時間點差異顯著(p<0.05)；圖2～圖4同。

豬肉宰后45 min的 pH一般為6.1～6.4[20]。本實驗中,正常肉與PSE肉的pH都隨貯藏時間的延長而下降,正常肉宰后45 min時的pH在5.8～5.9之間,可能與豬的品種，肉樣的取樣量有關(guān);PSE肉宰后45 min時的pH在5.6左右,顯著低于正常肉(p<0.05),說明通過宰后45 min的pH可初步辨別PSE肉。豬肉的pH下降到5.4左右時便不會再下降,這是由于肌肉過低的酸度會使肌糖原無氧酵解過程中的酶被抑制而失活,酸性物質(zhì)也隨之停止產(chǎn)生,這時的pH達(dá)到了宰后最低值,被稱為極限pH[21]。本實驗中,正常肉宰后24 h約為5.6,其未到達(dá)極限pH,PSE肉的最低pH出現(xiàn)在宰后24 h,約為5.5,由于肉樣的種類與數(shù)量存在不同,所以與馬莉等[20]研究結(jié)果略有差異。

2.3 宰后肌肉溫度的變化

宰后各時間點,正常肉樣的溫度均低于PSE肉樣。宰后45 min和3 h,PSE肉的溫度顯著高于正常肉的溫度(p<0.05),而在之后的測定時間點(9、12、24 h)兩種肉樣的溫度無顯著差異(p>0.05)。正常肉樣組在宰后45 min與3、12、24 h之間溫度存在顯著差異(p<0.05),宰后9～12 h之間,溫度無顯著差異(p>0.05)。PSE肉樣組在宰后45 min與3、9、12 h與24 h之間，溫度存在顯著差異(p<0.05),宰后9 h到12 h之間,溫度無顯著差異(p>0.05)。

剛屠宰的豬溫度大概在38.3～41.7 ℃間,宰后24 h溫度降至3.4 ℃左右,與本實驗的結(jié)果基本一致。此外,宰后45 min的溫度同樣可以像宰后45 min的pH一樣準(zhǔn)確的預(yù)測汁液流失,其原因是宰后45 min的溫度影響著宰后45 min的pH變化。因為宰后肌肉溫度下降時,導(dǎo)致代謝酶的活力也下降,從而減緩了宰后肌肉的代謝速率,降低了pH的下降速率,提高了肉的保水性[22]。

圖2 宰后肌肉溫度的變化Fig.2 Changes of temperature during postmortem

2.4 不同肉樣的汁液流失率

宰后第24 h的兩組肉樣的汁液流失率如圖3所示,兩組肉樣的汁液流失率存在顯著差異(p<0.05)。PSE肉的汁液流失率比正常肉高62.65%。

圖3 宰后24 h正常肉與PSE肉的汁液流失率Fig.3 After 24 h drip loss in RFN and PSE pork注:*表示組間差異顯著(p<0.05)。

豬肉在分割、儲藏過程汁液流失率范圍可達(dá)2%～10%之間。Wu等[23]研究表明，宰后第24 h，PSE肉的汁液流失率比正常肉高75.22%。

2.5 踝蛋白的降解

2.5.1 宰后踝蛋白降解情況 如圖4所示,宰后兩組肉樣的踝蛋白相對光密度值都隨時間的延長而逐漸降低,即踝蛋白隨時間的延長逐漸降解。其中,正常肉樣組的踝蛋白相對光密度值在宰后45 min與3、9、12、24 h之間均存在顯著差異(p<0.05),9 h與12 h之間無顯著差異(p>0.05);PSE肉樣組的踝蛋白相對光密度值在宰后45 min～9 h無顯著差異(p>0.05),9 h到24 h之間存在顯著差異(p<0.05)。宰后9 h正常肉樣與PSE肉樣的踝蛋白相對光密度值差異顯著(p<0.05),而在其余的測定時間點(45 min、3、12、24 h)兩種肉樣的踝蛋白的相對光密度值無顯著差異(p>0.05)。

圖4 正常肉與PSE肉踝蛋白的降解Fig.4 Talin degradation in RFN and PSE

踝蛋白對肌細(xì)胞維持特定形態(tài)以及系水力都起著重要的作用[24],中間絲能夠?qū)⑾噜徏≡w維連接起來,踝蛋白是組成中間絲結(jié)構(gòu)的主要蛋白質(zhì)[25]。如果中間絲結(jié)構(gòu)在僵直過程中保持完整,僵直產(chǎn)生的力通過踝蛋白傳遞到整個細(xì)胞，使細(xì)胞體積減小,肌細(xì)胞間隙變大,導(dǎo)致汁液流失的產(chǎn)生。Kristensen等[9]研究發(fā)現(xiàn),宰后第1 d踝蛋白開始降解,第4 d踝蛋白降解了68%。Tomisaka等[26]研究了宰后肌肉系水力的變化,發(fā)現(xiàn)踝蛋白在宰后第4 d降解為最初的25%。本實驗中,正常肉樣與PSE肉樣的踝蛋白在宰后45 min開始降解,正常肉樣組和PSE肉樣組的踝蛋白在宰后24 h分別降解了70.10%和66.66%,降解速度與Kristensen等[9]、Tomisaka等[26]研究結(jié)果相比加快。

2.5.2 踝蛋白的western-blot結(jié)果 Wu等[23]、陳韜等[27]研究表明,經(jīng)SDS-PAGE電泳得到的踝蛋白的條帶位置位于180～245 kDa中間,因此在此位置進(jìn)行抗體孵育并進(jìn)行顯影分析,得到圖5踝蛋白的western-blot結(jié)果,根據(jù)試驗結(jié)果可觀察踝蛋白的降解情況。

由圖5可看出,PSE肉樣組的蛋白條帶顏色較淺,說明PSE肉樣組在宰后各時間點的踝蛋白相對光密度值均比正常肉樣組在宰后各時間點的踝蛋白相對光密度值低,則可判斷出PSE肉樣降解速度更快。

圖5 踝蛋白的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖Fig.5 Western Blot patterns of Talin in RFN and PSE

2.6 宰后pH、溫度、踝蛋白相對光密度值與汁液流失率的相關(guān)性

2.6.1 宰后pH、溫度與汁液流失率的相關(guān)性 由表2可見,宰后各時間點(45 min、3、9、12、24 h)的pH與汁液流失率均呈負(fù)相關(guān),其中,宰后45 min和24 h的pH與汁液流失率呈顯著負(fù)相關(guān),這與Lonergan等[28]研究一致。有研究發(fā)現(xiàn),宰后24 h的pH與宰后肌肉的持水性、色澤,感官品質(zhì)有關(guān),也與肌肉中蛋白質(zhì)的變性及降解程度有關(guān)。宰后肌肉酸度過高會導(dǎo)致持水力下降[29],本試驗中PSE肉的pH始終低于正常肉,且pH與汁液流失率之間呈顯著負(fù)相關(guān),說明宰后低pH會導(dǎo)致高汁液流失率。

表2 宰后肌肉pH、溫度與汁液流失率的相關(guān)性(N=19)Table 2 Correlation between pH,temperature、relative and drip loss of pork during postmortem(N=19)

宰后各時間點(45 min、3、9、12與24 h)的溫度與汁液流失率均呈正相關(guān),其中,宰后45 min與3 h的溫度與汁液流失率呈顯著正相關(guān)。說明宰后早期高溫會降低肌肉持水性,這與的Sch?fer等[12]研究報道結(jié)果一致。

2.6.2 宰后肌肉踝蛋白相對光密度值與汁液流失率的相關(guān)性 由表3所示,宰后45 min、3、9、24 h的踝蛋白的相對光密度值與汁液流失率呈正相關(guān),說明宰后45 min、3、9、24 h的踝蛋白相對光密度值越低,降解程度越高,汁液流失率越小;宰后12 h的踝蛋白平均光密度值與汁液流失率呈負(fù)相關(guān),說明宰后12 h時,踝蛋白相對光密度值越低,降解程度越高,汁液流失率越大,但宰后各時間點的踝蛋白的相對光密度值與汁液流失率均無顯著相關(guān)性。這與Annettte Schafer等[12]報道的結(jié)果一致,即宰后早期(3～24 h)踝蛋白的降解與汁液流失無關(guān)。但有研究表明踝蛋白的完整度在宰后2、3、5 d與持水性呈顯著正相關(guān)，且踝蛋白降解使肌肉的持水性增強。

表3 宰后踝蛋白的相對光密度值與汁液流失率的相關(guān)性(N=19)Table 3 Correlation between relative optical density of Talin and drip loss of pork during postmortem(N=19)

2.7 宰后pH、溫度與踝蛋白相對光密度值的相關(guān)性

由表4所示,宰后各時間點(45 min、3、9、12、24 h)pH與宰后45 min、3、9、12 h踝蛋白的相對光密度值均呈正相關(guān),其中宰后45 min的pH與宰后45 min的踝蛋白相對光密度值呈顯著正相關(guān);宰后12 h的pH與宰后9 h的踝蛋白相對光密度值呈顯著正相關(guān),說明宰后pH越低,踝蛋白的相對光密度值越低,降解程度越高,汁液流失率越小,踝蛋白的持水性越強;宰后45 min與24 h的pH與宰后24 h的踝蛋白相對光密度值呈負(fù)相關(guān)且無顯著相關(guān)性,說明宰后pH越低,踝蛋白的相對光密度值越高,降解程度越低。

表4 宰后踝蛋白的相對光密度值與pH,溫度的相關(guān)性(N=19)Table 4 Correlation between relative optical density of Talin and pH,temperature of pork at postmortem(N=19)

有研究發(fā)現(xiàn),極限pH與肌肉中蛋白質(zhì)的變性及降解程度有關(guān)[30]。本實驗中,初始pH與踝蛋白的降解程度呈顯著負(fù)相關(guān);極限pH與踝蛋白降解程度呈正相關(guān)且無顯著相關(guān)性,說明極限pH與蛋白質(zhì)降解程度無關(guān)。由于所選肉樣的種類不同且宰后測定時間點不同,所以與Giuseppe Bee等[29]研究結(jié)果有差異。

3 結(jié)論

宰后正常組的pH高于PSE組,但溫度卻低于PSE組,說明宰后肌肉pH和溫度聯(lián)合變化,肌肉的高酸度(低pH)和高溫引起了肌肉持水性的降低。據(jù)此可以推斷,宰后由于在高溫和低pH的共同作用,PSE肉的持水性大大降低。此外,宰后早期低pH是導(dǎo)致PSE肉的產(chǎn)生的重要因素。

宰后兩組肉樣的踝蛋白都隨著貯藏時間的推移而降解,正常肉樣的踝蛋白降解程度低于PSE肉樣組的踝蛋白降解程度,宰后各時間點(45 min、3、9、12 h)踝蛋白的相對光密度值與汁液流失率呈不顯著正相關(guān)(p>0.05)。說明PSE肉樣的踝蛋白降解速度更快,踝蛋白的降解不可以減少豬肉的汁液流失率,對持水性無影響。