侯小偉，仁欽索麗，格日勒圖，高金龍

（1.烏海職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，內(nèi)蒙古 烏海 016000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310000）

不同部位的動物肌內(nèi)結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)和組成不同，導(dǎo)致不同部位肌肉在烹飪過程中的韌性有很大差異[1-3]。嫩度是消費(fèi)者評價羊肉食用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]。Archile-Contreras等[5]研究表明，不同肌肉間肌束膜中膠原蛋白的溶解性與飼養(yǎng)時的營養(yǎng)有關(guān)。Torrescano等[6]研究表明，不同肌肉間膠原蛋白的溶解性有差異，背最長肌中膠原蛋白的溶解性大于岡下肌和半膜肌。Archile-Contreras[5]、Cassar-Malek[7]等的研究表明，飼養(yǎng)方式對不同肌內(nèi)膠原蛋白的溶解性有一定影響。Archile-Contreras等[5]發(fā)現(xiàn)牛的生長速率受每日攝入熱值高低的影響，高能量的飼養(yǎng)使得背最長肌和半腱肌的膠原蛋白含量降低，也在不同程度上影響膠原蛋白的熱溶解性。Modzelewska-Kapitu?a等[8]研究發(fā)現(xiàn)，攝食強(qiáng)度對膠原蛋白含量和岡下肌肌肉的食用品質(zhì)有一定影響，攝食強(qiáng)度高的牛肉中脂肪含量和可溶性膠原蛋白含量較高。Voutila等[9]利用差示掃描量熱法研究豬肉不同部位肌內(nèi)結(jié)締組織的熱變性，認(rèn)為不同部位肌內(nèi)結(jié)締組織的熱變性不同。Latorre[10]、Lepetit[11]等認(rèn)為熟肉制品韌性與肌肉膠原蛋白有關(guān)，在烹飪過程中，肌束膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)由于受熱變得致密，肌原纖維蛋白受熱失水，導(dǎo)致膠原蛋白在熟肉中的含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致收縮力變大，剪切力增加。

本研究測定不同飼養(yǎng)方式和屠宰季節(jié)的烏珠穆沁羊半腱肌和背最長肌結(jié)締組織內(nèi)膠原蛋白的含量、膠原蛋白熱溶解性、吡啶諾啉含量和結(jié)締組織熱變性溫度，旨在為改善家畜肉質(zhì)和提升畜牧業(yè)產(chǎn)品加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用冬、夏季屠宰的烏珠穆沁草原自然放牧和錫林浩特毛登牧場圈養(yǎng)的18 月齡健康、膘情中、體態(tài)基本相近的去勢公羊各6 只。其中屠宰季節(jié)夏季為8月，冬季為2月，自然放養(yǎng)公羊?yàn)榻K年放牧，不補(bǔ)飼，只在雪大不能放牧?xí)r稍加補(bǔ)草，圈養(yǎng)公羊采用某品牌飼料配方飼喂。

Tris-base、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、對二甲氨基苯甲醛 南京博爾迪生物科技有限公司；L-羥脯氨酸、馬來酸、組氨酸、透析袋美國Sigma公司；氯化鈣、氯胺T、異丙醇、磷酸二氫鉀、氯化鎂、氯化鉀、硫代硫酸鈉、氯化鈉 天津市化學(xué)試劑三廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D組織搗碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-10C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；DSH-300A恒溫水浴振蕩器 上海雅榮生化設(shè)備有限公司；H2500R-2冷凍高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱、烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DZ3335差示掃描量熱儀 南京大展機(jī)電技術(shù)研究所；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用有限公司；Agilent 1100 HPLC系統(tǒng) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

從屠宰96 h后的羊胴體上取下半腱肌和背最長肌，放入冷凍恒溫采樣箱，實(shí)驗(yàn)前將樣品于4 ℃條件下解凍，去掉外部的結(jié)締組織（肌外膜）。

1.3.2 結(jié)締組織的分離

參照Fujii等[12]的方法。向100 g肌肉樣品中加入250 mL pH 7.2、含有0.1 mol/L KCl和0.01 mol/L Tris-馬來酸的緩沖液破碎，再加入250 mL緩沖液攪拌12 h；過濾后在濾渣上加250 mL pH 6.4（0.6 mol/L KCl、0.01 mol/L KH2PO4和Na4P2O4、0.001 mol/L MgCl2）的緩沖液攪拌12 h，離心（3 000×g，30 min）后向沉淀中加250 mL 0.6 mol/L KCl、0.06 mol/L Na2S2O3溶液，攪拌12 h后離心（3 000×g，30 min）；用蒸餾水洗滌沉淀，離心（6 000×g，30 min）后冷凍干燥。

1.3.3 肌內(nèi)膜和肌束膜的分離

參照Light等[13]的方法。向100 g肌肉樣品中加入500 mL 0.05 mol/L CaCl2溶液破碎，過濾，濾液中為粗肌內(nèi)膜，濾渣為粗肌束膜。濾液在4 ℃條件下靜置12 h，向沉淀中加入500 mL pH 7.4含有0.025 mol/L NaCl、0.002 5 mol/L組氨酸、0.005 mol/L Tris-HCl的緩沖溶液，攪拌5 min后離心（3 000×g，20 min）分離；沉淀中依次分別加等量上述緩沖液和pH 7.4的5 mmol/L Tris-HCl緩沖液，靜置后離心（3 000×g，20 min）分離；最后沉淀中加入pH 7.4、含有0.1% SDS、5 mmol/L Tris-HCl的緩沖液攪拌后離心（3 000×g，20 min），沉淀在蒸餾水中透析12 h后冷凍干燥。將粗肌束膜在500 mL pH 7.4含有0.1% SDS、5 mmol/L Tris-HCl的緩沖液中靜置5 min后離心（3 000×g，20 min），沉淀在蒸餾水中透析12 h，冷凍干燥。

1.3.4 膠原蛋白含量和熱溶解性測定

參照Bergman[14]、Hill[15]等的方法。利用分光光度法于558 nm波長處測定樣品中羥脯氨酸的含量，加熱溶解的膠原蛋白含量為測得的羥脯氨酸含量乘以7.52，不溶性膠原蛋白含量為將沉淀測得羥脯氨酸含量乘以7.25。結(jié)締組織、肌內(nèi)膜和肌束膜中的膠原蛋白含量即可溶性和不溶性膠原蛋白含量的總和。膠原蛋白的熱溶解性按照下式計算。

1.3.5 吡啶諾啉含量測定

向30 mg結(jié)締組織中加入45 mL 6 mol/L HCl水解，于120 ℃條件下放置12 h[16]。水解剩余物水浴蒸發(fā)干燥去除HCl，用NaOH中和殘留的HCl，真空干燥。測定吡啶諾啉含量前用200 μL 0.5%七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）溶解后，用高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析[17]。

1.3.6 結(jié)締組織熱變性溫度測定

在差示掃描量熱儀樣品坩堝中準(zhǔn)確稱取30 mg樣品，壓緊密封，以等量氧化鋁做參比，將樣品以1 ℃/min的速率從20 ℃加熱升溫至100 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SAS軟件的方差分析模型對不同屠宰季節(jié)和飼養(yǎng)條件下同一部位肌肉中結(jié)締組織內(nèi)膠原蛋白的含量、膠原蛋白熱溶解性、吡啶諾啉含量和結(jié)締組織熱變性溫度的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏珠穆沁羊不同部位肌肉中的膠原蛋白含量

表 1 烏珠穆沁羊不同部位肌肉中膠原蛋白的含量Table 1 Collagen content in different muscles from Wuzhumuqin sheep mg/g

由表1可知：半腱肌樣品中膠原蛋白的含量高于背最長肌樣品；肌內(nèi)膜中膠原蛋白的含量高于肌束膜；夏季屠宰圈養(yǎng)烏珠穆沁羊的半腱肌和背最長肌中的膠原蛋白含量高于冬季；自然放養(yǎng)烏珠穆沁羊的半腱肌和背最長肌膠原蛋白含量高于圈養(yǎng)。飼養(yǎng)方式對烏珠穆沁羊背最長肌和半腱肌結(jié)締組織、肌內(nèi)膜樣品的膠原蛋白含量影響顯著（P＜0.05）；屠宰季節(jié)對自然放養(yǎng)、圈養(yǎng)烏珠穆沁羊的半腱肌和自然放養(yǎng)烏珠穆沁羊的背最長肌結(jié)締組織、肌內(nèi)膜的膠原蛋白含量影響顯著（P＜0.05）。這可能是由于烏珠穆沁羊在日?；顒舆^程中，半腱肌的運(yùn)動強(qiáng)度高于背最長肌，夏季的運(yùn)動量高于冬季，導(dǎo)致半腱肌樣品的膠原蛋白含量高于背最長肌，夏季樣品高于冬季；自然放養(yǎng)的運(yùn)動量遠(yuǎn)大于圈養(yǎng)，且二者獲取營養(yǎng)物質(zhì)的方式及來源存在差異，飼料喂養(yǎng)的烏珠穆沁羊肌肉內(nèi)有較高含量的肌原纖維蛋白和脂肪沉積，導(dǎo)致圈養(yǎng)烏珠穆沁羊的膠原蛋白含量低于放養(yǎng)。因此飼養(yǎng)方式和屠宰季節(jié)對樣品的膠原蛋白含量有較大影響，屠宰季節(jié)對放養(yǎng)烏珠穆沁羊的背最長肌膠原蛋白含量影響顯著，而對圈養(yǎng)影響不顯著，原因可能為放養(yǎng)烏珠穆沁羊的冬夏季間草料的差異，而圈養(yǎng)烏珠穆沁羊的四季均采用相同飼料喂養(yǎng)。

2.2 烏珠穆沁羊不同部位肌肉中膠原蛋白的熱溶解性

表 2 烏珠穆沁羊不同部位肌肉中膠原蛋白的熱溶解性Table 2 Heat-soluble collagen in different muscles from Wuzhumuqin sheep%

由表2可知：相同飼養(yǎng)條件下，夏季屠宰烏珠穆沁羊的膠原蛋白熱溶解性高于冬季，肌內(nèi)膜膠原蛋白熱溶解性最高，肌束膜最低；背最長肌膠原蛋白熱溶解性高于半腱肌。同一屠宰季節(jié)，圈養(yǎng)烏珠穆沁羊的膠原蛋白溶解性高于自然放養(yǎng)。相同條件下，背最長肌結(jié)締組織和肌束膜中膠原蛋白的溶解性高于半腱肌。飼養(yǎng)條件和屠宰季節(jié)對背最長肌結(jié)締組織、肌內(nèi)膜中膠原蛋白的熱溶解性均影響顯著（P＜0.05）；半腱肌肌束膜膠原蛋白的熱溶解性受屠宰季節(jié)的影響不顯著。

Archile-Contreras等[5]研究表明，半腱肌的總膠原蛋白含量比背最長肌高，膠原蛋白熱溶解性較低，該研究利用玉米、苜蓿和草飼養(yǎng)動物后，測定動物半腱肌和背最長肌中膠原蛋白的含量和熱溶解性，結(jié)果表明，用草飼養(yǎng)的動物半腱肌中總膠原蛋白含量最高，苜蓿次之，玉米飼養(yǎng)的動物半腱肌中總膠原蛋白含量最低，膠原蛋白熱溶解性變化不顯著（P＞0.05）。Maltin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，用青草飼養(yǎng)的動物背最長肌中膠原蛋白含量比用糧食飼養(yǎng)要高，與本研究結(jié)果一致。Bailey[1]、Li[19]等的研究表明，半腱肌中總膠原蛋白含量較高、膠原蛋白熱溶解性較低的原因可能與運(yùn)動有關(guān)。然而也有其他研究[20-21]認(rèn)為膠原蛋白含量不受飼養(yǎng)方式的影響。Muir[22]、Purslow[23]等認(rèn)為，膠原蛋白對肉嫩度的影響既取決于其含量也取決于其熱溶解性。Fishell[24]、Wu[25]等研究發(fā)現(xiàn)，高能量飼料喂養(yǎng)的牛由于具有較高的生長速率而表現(xiàn)出更快的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率，因此它們的肉中含有較高比例的新合成膠原蛋白，因此具有較高的膠原蛋白熱溶性；3 種肌肉結(jié)締組織的熱穩(wěn)定性不同，岡下肌與背最長肌和半腱肌相比有較高熱收縮溫度和膠原蛋白溶解性，岡下肌膠原蛋白含量最高，背最長肌最低。這也與本研究結(jié)果一致。

2.3 烏珠穆沁羊不同部位結(jié)締組織中的吡啶諾啉含量

表 3 烏珠穆沁羊不同部位結(jié)締組織中吡啶諾啉的含量Table 3 Pyridinoline content in connective tissue of different muscles from Wuzhumuqin sheep%

圖 1 烏珠穆沁羊結(jié)締組織中吡啶諾啉與可溶解性膠原蛋白的含量Fig. 1 Contents of pyridine and soluble collagen in connective tissue from Wuzhumuqin sheep

由表3可知，飼養(yǎng)方式和屠宰季節(jié)對烏珠穆沁羊半腱肌和背最長肌結(jié)締組織中吡啶諾啉的含量均影響顯著（P＜0.05），其中自然放養(yǎng)烏珠穆沁羊結(jié)締組織中吡啶諾啉的含量較圈養(yǎng)偏高，冬季屠宰烏珠穆沁羊結(jié)締組織中吡啶諾啉的含量高于夏季，半腱肌中吡啶諾啉含量高于背最長肌。由圖1可知，吡啶諾啉含量與膠原蛋白的溶解性成反比。吡啶諾啉是一種成熟的膠原蛋白交聯(lián)，其溶解性很低[16]。吳瓊等[26]發(fā)現(xiàn)，動物肌肉內(nèi)膠原蛋白分子交聯(lián)的形成與家畜品種、年齡、肌肉部位以及飼養(yǎng)等因素有關(guān)。張文等[27]發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白之間交聯(lián)程度的大小是影響膠原纖維溶解性的主要因素。以上結(jié)論與本研究結(jié)果一致。由于膠原蛋白的熱溶解性受飼養(yǎng)方式和屠宰季節(jié)影響較大，吡啶諾啉含量也受飼養(yǎng)方式和屠宰季節(jié)影響顯著。Young等[16]發(fā)現(xiàn)，在測定膠原蛋白熱溶解性時，加熱處理并離心時，上清液中沒有測出吡啶諾啉，全部保留在沉淀物中，表明所有吡啶諾啉在加熱后均保持不溶，因此作者認(rèn)為吡啶諾啉可以解釋部分肌內(nèi)膠原蛋白的熱溶解性，但是與感官和剪切性能關(guān)系較小。關(guān)于吡啶諾啉含量對肉品質(zhì)的影響需要進(jìn)一步研究。

2.4 烏珠穆沁羊不同部位肌肉的熱變性溫度

表 4 烏珠穆沁羊不同部位肌肉的熱變性溫度Table 4 Thermal denaturation temperature of different muscles from Wuzhumuqin sheep℃

由表4可知，半腱肌結(jié)締組織、肌內(nèi)膜和肌束膜的熱變性溫度均低于背最長肌，相同季節(jié)屠宰時，自然放養(yǎng)烏珠穆沁羊肌肉的熱變性溫度高于圈養(yǎng)。這可能是由于肌內(nèi)膠原蛋白的變性峰值溫度受膠原蛋白與蛋白聚糖相互作用的影響[28]。膠原蛋白和蛋白聚糖對熱不穩(wěn)定，因此受熱后它們的特性會發(fā)生變化。蛋白多糖的熱變性對膠原蛋白的分子力學(xué)結(jié)構(gòu)并不能起到直接作用，但它與膠原纖維分子的相互作用決定了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明，在結(jié)締組織加熱過程中背最長肌較半腱肌穩(wěn)定、自然放養(yǎng)較圈養(yǎng)穩(wěn)定。

3 討 論

烏珠穆沁羊半腱肌和背最長肌結(jié)締組織的特性受飼養(yǎng)方式和屠宰季節(jié)影響較大。夏季屠宰烏珠穆沁羊半腱肌和圈養(yǎng)烏珠穆沁羊的背最長肌中的膠原蛋白含量及其熱溶解性高于冬季，而吡啶諾啉含量為冬季高于夏季，其中半腱肌中總膠原蛋白和吡啶諾啉含量較高，膠原蛋白熱溶解性和熱變性溫度較低，背最長肌則相反；自然放養(yǎng)烏珠穆沁羊的半腱肌和背最長肌中膠原蛋白和吡啶諾啉的含量及熱變性溫度高于圈養(yǎng)，而熱溶解性則相反，吡啶諾啉含量與膠原蛋白的溶解性成反比。

飼養(yǎng)方式對烏珠穆沁羊背最長肌中膠原蛋白的含量及其熱溶解性和吡啶諾啉含量均影響顯著（P＜0.05）；對半腱肌結(jié)締組織、肌內(nèi)膜中膠原蛋白含量、結(jié)締組織和肌束膜中膠原蛋白的熱溶解性及結(jié)締組織的吡啶諾啉含量均影響顯著（P＜0.05）。

屠宰季節(jié)對烏珠穆沁羊半腱肌中的膠原蛋白含量、結(jié)締組織熱變性溫度和吡啶諾啉含量均影響顯著（P＜0.05）；對背最長肌中膠原蛋白的熱溶解性、吡啶諾啉含量和自然放養(yǎng)烏珠穆沁羊的背最長肌結(jié)締組織、肌內(nèi)膜中膠原蛋白含量影響顯著（P＜0.05）。

飼養(yǎng)方式對烏珠穆沁羊背最長肌結(jié)締組織特性的影響大于半腱肌，屠宰季節(jié)對圈養(yǎng)烏珠穆沁羊背最長肌結(jié)締組織特性的影響大于圈養(yǎng)。薛寶玲[29]、陳代文[30]等認(rèn)為，自然放養(yǎng)方式較圈養(yǎng)不僅有助于動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的積累，還可以增加風(fēng)味物質(zhì)，如一些不飽和脂肪酸等。本課題組今后將進(jìn)一步研究飼養(yǎng)方式對肉中營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的影響。