彭俊，潘坤，劉崢嶸，秦裕輝，彭清華

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）中最常見(jiàn)和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致DM患者視力下降的主要原因，若不及時(shí)治療，可造成不可逆的視功能的損害。秦裕輝教授認(rèn)為，糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要病機(jī)為肝腎虧虛、脈絡(luò)瘀阻，在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了用于治療DR的雙丹明目膠囊。前期研究表明，雙丹明目膠囊能有效降低DR大鼠血糖和糖化血紅蛋白含量，降低血小板黏附率，改善血液流變性，促進(jìn)血液循環(huán)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)觀察了雙丹明目膠囊對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取健康，無(wú)眼部疾患，1個(gè)月齡SD大鼠 40 只，體質(zhì)量 200～250 g，SPF 級(jí)，遠(yuǎn)交系，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前檢查雙眼眼部情況無(wú)異常，排除全身病變。動(dòng)物置于18～20℃，相對(duì)濕度60%～70%，通風(fēng)干燥的SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，予以經(jīng)嚴(yán)格消毒的實(shí)驗(yàn)鼠生長(zhǎng)顆粒料及Ⅲ級(jí)清潔飲用水飼養(yǎng)，每隔2 d清洗消毒籠具、飲水器具。

實(shí)驗(yàn)藥品雙丹明目膠囊（女貞子、旱蓮草、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮、丹參、三七、菝葜、牛膝等），由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080062。羥苯磺酸鈣膠囊（多貝斯），寧夏康亞藥業(yè)有限公司，250mg/粒，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030809。重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液（恩度），煙臺(tái)麥得津生物工程股份有限公司，15 mg/3 ml，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S20050088。

實(shí)驗(yàn)試劑血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-a（vascular endothelial growth factor，VEGF-a）、VEGF-b、VEGF-c、胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1，F(xiàn)lk-1），武漢博士德生物技術(shù)有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），Sigma公司；戊巴比妥鈉，上海化學(xué)試劑分裝廠；蘇木精-伊紅，北京鼎國(guó)生物公司；4%多聚甲醛、1%餓酸、丙酮、Epon812環(huán)氧樹脂、醋酸鈾、檸檬酸鉛、醋酸異戊脂，湖南福滋堂生物公司；4%多聚甲醛，湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供；Harris蘇木素、伊紅、3%過(guò)氧乙酸，北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供。

實(shí)驗(yàn)器材JY3002型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海南陽(yáng)儀器有限公司；LEICA DM LB2型顯微照相系統(tǒng)，德國(guó)LEICA公司；Shandon325型石蠟切片機(jī)，英國(guó)Shandon公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司；LEICA顯微鏡，德國(guó)LEICA公司；JSM-1200透射電鏡，日本JEOL公司；雙目顯微鏡，德國(guó)Motic公司；雙目顯微照相機(jī)，德國(guó)Motic公司；RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司；Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，深圳市深沅恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分組動(dòng)物購(gòu)回常規(guī)飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字法將40只大鼠分為4組，每組10只大鼠20只眼。A組：空白組（正常組）；B組：模型對(duì)照組；C組：雙丹明目組；D組：陽(yáng)性對(duì)照組。

造模除A組外的30只大鼠進(jìn)行造模，造模前大鼠禁食10 h，自由飲水。STZ 50mg/kg的劑量一次性大鼠尾靜脈注射。A組鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。72 h后取尾靜脈血，強(qiáng)生血糖測(cè)試儀測(cè)血糖；尿糖試紙定性測(cè)尿糖?？崭寡菨舛龋?6.7 mmol/L、尿糖在+++以上者，即為糖尿病大鼠。造模后觀察1周，穩(wěn)定者為造模成功，然后開始計(jì)算病程。造模后無(wú)大鼠死亡，2只大鼠血糖值偏低，進(jìn)行第2次尾靜脈注射后達(dá)標(biāo)。

給藥方法各組動(dòng)物自造模后1周開始連續(xù)灌胃，用藥4周后，處死一半動(dòng)物（各5只大鼠），其余動(dòng)物繼續(xù)灌胃用藥4周，共8周，再處死。各組大鼠均不限飲食，每日更換墊料1次，按時(shí)通風(fēng)，保持環(huán)境安靜。（1）空白組、模型組：以生理鹽水10 ml/kg灌胃。（2）雙丹明目膠囊組：使用雙丹明目膠囊溶液灌胃，劑量12.5 ml/kg。（3）陽(yáng)性對(duì)照組：用羥苯磺酸鈣溶液灌胃+重組人血管內(nèi)皮抑制素玻璃體內(nèi)注射[2]，羥苯磺酸鈣灌胃1次/d，重組人血管內(nèi)皮抑制素5g/L，造模后第10天開始玻璃體注射，1次/10 d。

取材2%戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉后斷頭法處死動(dòng)物，即刻摘除眼球以10%的福爾馬林固定24 h，去除眼前節(jié)，分離出視網(wǎng)膜組織，流水沖洗8 h，經(jīng)梯度酒精脫水后，行浸蠟、包埋、切片（厚度 4 μm）。

視網(wǎng)膜組織形態(tài)的光鏡觀察HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色標(biāo)本視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。

視網(wǎng)膜組織形態(tài)的電鏡觀察部分標(biāo)本 （材料小于1 mm3）經(jīng)2.5%戊二醛前固定，清洗，1%餓酸4℃下固定3 h，梯級(jí)乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂與丙酮溶液浸透30 min，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片光鏡觀察定位后做超薄切片，經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸鈾雙重染色后采用JSM-1200透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

成模后用藥第4周：空白組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，視錐視桿細(xì)胞排列整齊，無(wú)細(xì)胞水腫、無(wú)壞死、無(wú)血管增生（圖1A）。模型組，視網(wǎng)膜組織水腫明顯，毛細(xì)血管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，纖維組織增生明顯（圖1B）。雙丹明目組，視網(wǎng)膜組織輕度水腫，結(jié)構(gòu)層次清晰，部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生（圖1C）。陽(yáng)性對(duì)照組，視網(wǎng)膜組織輕度水腫，結(jié)構(gòu)層次清晰，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯（圖1D）。

成模后用藥第8周：空白組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，視細(xì)胞各層結(jié)構(gòu)排列有序，形態(tài)規(guī)則，無(wú)細(xì)胞水腫、無(wú)壞死、無(wú)血管增生等（圖2A）。模型組，視網(wǎng)膜組織水腫明顯，排列疏松，形態(tài)欠規(guī)則，毛細(xì)血管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，纖維組織增生明顯（圖2B）。雙丹明目組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次基本清晰，組織稍有水腫，排列較疏松，形態(tài)較規(guī)則（圖2C）。陽(yáng)性對(duì)照組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次較清晰，組織水腫比模型組水腫明顯減輕，排列較疏松，形態(tài)尚規(guī)則（圖2D）。

圖1 造模成功后用藥第4周各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色像（×400）。1A.空白組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，視錐視桿細(xì)胞排列整齊，無(wú)細(xì)胞水腫、無(wú)壞死、無(wú)血管增生；1B.模型組，視網(wǎng)膜組織水腫明顯，毛細(xì)血管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，纖維組織增生明顯；1C.雙丹明目組，視網(wǎng)膜組織輕度水腫，結(jié)構(gòu)層次清晰，部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生；1D.陽(yáng)性對(duì)照組，視網(wǎng)膜組織輕度水腫，結(jié)構(gòu)層次清晰，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯

圖2 造模成功后用藥第8周各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色像（×400）。2A.空白組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，視細(xì)胞各層結(jié)構(gòu)排列有序，形態(tài)規(guī)則，無(wú)細(xì)胞水腫、無(wú)壞死、無(wú)血管增生等；2B.模型組，視網(wǎng)膜組織水腫明顯，排列疏松，形態(tài)欠規(guī)則，毛細(xì)血管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，纖維組織增生明顯；2C.雙丹明目組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次基本清晰，組織稍有水腫，排列較疏松，形態(tài)較規(guī)則；2D.陽(yáng)性對(duì)照組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次較清晰，組織水腫比模型組水腫明顯減輕，排列較疏松，形態(tài)尚規(guī)則

2.2 電鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)

成模后用藥第8周透射電鏡下觀察視網(wǎng)膜超微組織結(jié)構(gòu)：空白組，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，細(xì)胞間有較好的連接裝置，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管腔壁完整，基底膜連續(xù)、未見(jiàn)增厚（圖3A）。模型組，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，胞體變圓，突向管腔，線粒體腫脹，空泡化，基底膜增厚，部分增厚較明顯（圖3B）。雙丹明目組，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較完整，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜稍增厚，可見(jiàn)周細(xì)胞輕度水腫，線粒體腫脹，少數(shù)出現(xiàn)嵴消失及結(jié)構(gòu)紊亂，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯改變（圖3C）。陽(yáng)性對(duì)照組，組織結(jié)構(gòu)較完整，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管病變較輕，毛細(xì)血管腔壁較光整，基底膜未見(jiàn)明顯增厚，部分內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生，少數(shù)周細(xì)胞出現(xiàn)水腫，線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)稍欠清（圖 3D）。

圖3 造模成功后用藥第8周各組大鼠視網(wǎng)膜組織透射電鏡像。3A.空白組，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，細(xì)胞間有較好的鏈接裝置，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管腔壁完整，基底膜連續(xù)、未見(jiàn)增厚；3B.模型組，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，胞體變圓，突向管腔，線粒體腫脹，空泡化，基底膜增厚，部分增厚較明顯；3C.雙丹明目組，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較完整，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜稍增厚，可見(jiàn)周細(xì)胞輕度水腫，線粒體腫脹，少數(shù)出現(xiàn)嵴消失及結(jié)構(gòu)紊亂，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯改變；3D.陽(yáng)性對(duì)照組，組織結(jié)構(gòu)較完整，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管病變較輕，毛細(xì)血管腔壁較光整，基底膜未見(jiàn)明顯增厚，部分內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生，少數(shù)周細(xì)胞出現(xiàn)水腫，線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)稍欠清

3 討論

3.1 中醫(yī)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的認(rèn)識(shí)

中醫(yī)稱糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)椤跋蕛?nèi)障”[4]，根據(jù)患眼視覺(jué)變化及視力下降情況，將其納入不同的病癥中，如“視瞻昏渺”“云霧移睛”“血灌瞳神”“暴盲”等。對(duì)于本病的認(rèn)識(shí)，金代醫(yī)家張子和在《儒門事親》中指出：“消渴者，耗亂精神，過(guò)為其度，而燥熱郁盛所成也……可變?yōu)槿改炕騼?nèi)障”，認(rèn)為燥熱傷陰為其主要病機(jī)；明代趙獻(xiàn)可認(rèn)為“治消之法無(wú)分上中下，先治腎為急，惟六味八味及加減八味丸隨證而服，降其心火滋其腎水則渴自止也”。明代王肯堂所著《證治準(zhǔn)繩》亦云：“三消之久，精氣虧虛，則目無(wú)所見(jiàn)”，認(rèn)為本病為精血虧虛、目失所養(yǎng)而成。其后歷代醫(yī)家多在此基礎(chǔ)上加以研討發(fā)揮，多數(shù)認(rèn)為消渴病日久，精虧液少，不能上承目絡(luò)，目睛失養(yǎng)；或肝腎陰虛日甚，陰虛陽(yáng)亢，虛火上炎，灼傷目絡(luò)，而致視物模糊，甚至失明，概言之：陰精虧虛為其主要病機(jī)?，F(xiàn)代醫(yī)家借助眼底檢查、眼底血管造影等手段，并從血流變、微循環(huán)、血生化等方面對(duì)本病作了科學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)“血瘀”在其發(fā)病機(jī)理中具有重要作用，因此，導(dǎo)師秦裕輝教授認(rèn)為本病病因病機(jī)為：腎虛是根、陰虛為本、血瘀為標(biāo)，概言之“腎虛血瘀”為其主要病機(jī)。“虛”為氣血陰陽(yáng)的虛損；“瘀”為瘀血，它貫穿病機(jī)演變過(guò)程的始終。因虛致瘀，虛瘀夾雜，以虛為本，以瘀為標(biāo)，血瘀又是誘發(fā)和加快本病發(fā)展的病理基礎(chǔ)。故治療DR應(yīng)該以“滋腎活血”為基本法則。

基于這一法則，秦裕輝教授創(chuàng)制了雙丹明目膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080062），開發(fā)出國(guó)內(nèi)第一個(gè)專治糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥新藥，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。該藥由女貞子、旱蓮草、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮、丹參、三七、菝葜、牛膝等藥物組成。方中女貞子、旱蓮草滋補(bǔ)肝腎為君藥；山茱萸、山藥補(bǔ)腎養(yǎng)肝、健脾固精，丹參、三七養(yǎng)血活血、化瘀通絡(luò)共為臣藥；牡丹皮、澤瀉、茯苓、菝葜清肝瀉火、除濕利水為佐藥；牛膝味苦酸、性平，歸肝、腎經(jīng)，功能活血逐瘀、強(qiáng)筋壯骨且性善下行，可防血?dú)馍夏妫瑸槭顾?。諸藥合用共奏益腎養(yǎng)肝、活血明目之功，主治肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)所致的糖尿病視網(wǎng)膜病變。多中心臨床試驗(yàn)取得較好的療效[5-7]，證實(shí)該藥能改善患者眼底病變，促進(jìn)視力恢復(fù)，起到治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用。在2009年，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院、南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院聯(lián)合臨床應(yīng)用中，用雙丹明目膠囊與羥苯磺酸鈣（導(dǎo)升明）作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)治療后患者眼科檢查中的視力明顯提高。在治療8周、16周后的眼科檢查總分及微血管瘤計(jì)分，雙丹明目膠囊療效優(yōu)于導(dǎo)升明組，治療16周后視力檢查計(jì)分優(yōu)于導(dǎo)升明組，疾病顯效率、總有效率高于導(dǎo)升明組；而不良反應(yīng)率低于導(dǎo)升明組[7]。我們的前期藥理研究[1--3]也發(fā)現(xiàn)，雙丹明目膠囊（原名降糖明目膠囊）聯(lián)合降糖藥物能大幅度地促進(jìn)其降糖效果，單用也能降低血小板黏附率，改善血液流變性，有促進(jìn)血液循環(huán)作用。

3.2 雙丹明目膠囊對(duì)糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響

本研究通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，觀察雙丹明目膠囊對(duì)糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜病變的干預(yù)作用，光鏡下對(duì)其視網(wǎng)膜病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：雙丹明目組的大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)和超微組織結(jié)構(gòu)改變較模型組明顯好轉(zhuǎn)，其結(jié)構(gòu)層次清晰，僅組織輕度水腫，部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生；而模型組大鼠視網(wǎng)膜組織水腫明顯，毛細(xì)血管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，纖維組織增生明顯。電鏡下觀察視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管病變明顯，其基底膜增厚，部分增厚較明顯，內(nèi)皮細(xì)胞增生，有微絨毛樣突起，并向管腔突出，管腔狹窄，周細(xì)胞水腫、退變甚至消失，部分線粒體可見(jiàn)空泡化；神經(jīng)細(xì)胞病變更明顯，線粒體腫脹顯著，部分空泡化，染色質(zhì)溶解，嵴間隙擴(kuò)張甚至消失，視細(xì)胞外節(jié)膜盤甚至有斷裂、溶解。雙丹明目膠囊治療8周后，大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管病變輕微，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管腔壁較光整，基底膜未見(jiàn)增厚，僅少數(shù)毛細(xì)血管周細(xì)胞水腫，線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)稍欠清，部分內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生。說(shuō)明雙丹明目膠囊能明顯改善糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜組織形態(tài)和超微組織結(jié)構(gòu)，能改善DR大鼠視網(wǎng)膜血管微結(jié)構(gòu)，抑制新生血管的增生。