王順民,卞紫秀,汪建飛,馬文雅

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

谷物、豆類種子發(fā)芽后，其營養(yǎng)成分及礦物質(zhì)含量增加，尤其限制性氨基酸含量增加，故使其消化率和生物利用率顯著提高。同時(shí)發(fā)芽種子及芽苗中游離氨基酸、黃酮和酚類物質(zhì)等功能活性成分的含量也顯著提高[1]，從而使其具有獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值[2]。研究表明，磁場(chǎng)、電場(chǎng)等物理因素處理均會(huì)對(duì)生物組織表現(xiàn)出一定的生物效應(yīng)[3]，從而對(duì)萌發(fā)胚芽生長有調(diào)控作用[4, 5]。微波屬于一種電磁波，一定功率的微波能有效激活植物種子萌發(fā)期的超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫(Catalase，CAT)等酶類的活性，促進(jìn)種子萌發(fā)及誘導(dǎo)種子中一些生物活性成分的合成。微波預(yù)處理可使植物幼苗葉片POD、SOD等同工酶的基因表達(dá)發(fā)生變異而起促進(jìn)作用[5]，這種作用可顯著增加種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、莖長、根長和總物質(zhì)的量，并且其與微波功率的大小相關(guān)[6, 7]。植物種子經(jīng)微波處理后，其相對(duì)幼苗活力指數(shù)可提高達(dá)18.67%[8]。大豆經(jīng)微波處理8 s，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)顯著提高，芽苗中蔗糖含量明顯增加[9]。白蘭瓜種子經(jīng)低功率微波處理后，其萌發(fā)期的淀粉酶被激活，種子萌發(fā)活力提高[10]。苜蓿種子經(jīng)800 W微波處理，其首日發(fā)芽率和種子內(nèi)固氮菌的固氮酶活性分別比對(duì)照高出122%和104.9%[11]。低功率 (30%)預(yù)處理的冬小麥，萌發(fā)后幼苗葉片中POD和SOD同工酶的活性提高，種子萌發(fā)被促進(jìn)。而高功率 (50%～80%)處理則起抑制作用，且隨功率及時(shí)間的增加而抑制作用增強(qiáng)，且80%功率處理50 s，種子萌發(fā)能力完全喪失[12]。而鹽脅迫過的小麥幼苗經(jīng)微波處理后，其葉中丙二醛 (Malonaldehyde，MDA)含量和氧化型谷胱甘肽 (Oxidative glutathione，GSSG)等抗氧化酶酶活性均可恢復(fù)到接近于未經(jīng)鹽脅迫處理時(shí)[5, 13]。說明適當(dāng)劑量的微波處理能夠提高種子幼苗的萌發(fā)和增強(qiáng)耐鹽等不良環(huán)境的能力。豌豆(PisumsativumL.)是世界第四大豆類作物，而我國是世界第二大豌豆生產(chǎn)國。促進(jìn)豌豆種子的萌發(fā)，尤其是營養(yǎng)成分富集的方法有鹽脅迫法和60Co-γ射線、秋水仙素及甲基磺酸乙酯等誘變處理法，但這些方法均不同程度的存在安全危害。因此，研究微波對(duì)豌豆萌發(fā)，探研微波的生物非熱效應(yīng)對(duì)植物種子體內(nèi)生理生化的影響，將其有利的影響利用在作物栽培或植物育種上具有實(shí)用價(jià)值。用微波調(diào)控植物的生長發(fā)育，提高其酶活性、增加芽苗中營養(yǎng)成分的含量，將有著重要的生物學(xué)意義。因此，本文以白豌豆種子為原料，采用不同微波功率和時(shí)間處理萌發(fā)后的豌豆種子，研究微波處理對(duì)豌豆種子的發(fā)芽率和芽長及芽苗生長中還原糖、總黃酮等成分的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料、器材

1.1.1 試驗(yàn)原料及藥品 實(shí)驗(yàn)原料：新疆白豌豆(PisumsativumL.)。江西南昌進(jìn)賢縣綠色芽苗菜有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)器材 紫外可見分光光度計(jì)，UV-5800PC型，上海元析儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，PYX-DHs·350-Bs，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平，JY1002，上海良平儀器儀表有限公司；微波設(shè)備，JHFWB-1.0S型，南京金海豐微波科技有限公司；冷凍離心機(jī)，TGL-16A，長沙平凡儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理 選擇顆粒飽滿的種子，以去離子水沖洗干凈。種子經(jīng)1%次氯酸鈉溶液消毒3～5 min。后用無菌水反復(fù)沖洗。以無菌濾紙吸干。

1.2.2 試驗(yàn)方法 微波處理：取經(jīng)消毒后的種子分成若干組(每組50粒)，均勻鋪置于15 cm的玻璃皿中，后置入微波設(shè)備中，采用6種不同的微波功率與時(shí)間組合(100W10s，200W10s，300W10s，100W30s，200W30s，300W30s)[9]進(jìn)行微波處理。微波腔內(nèi)溫度控制為室溫25℃±2℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 發(fā)芽率、最終發(fā)芽率 發(fā)芽種子：種子胚根突破種皮，長度達(dá)種子長度1/2時(shí)，即為發(fā)芽種子。發(fā)芽率(Germination Rate, GR)：豌豆種子在1 d內(nèi)的全部正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供測(cè)豆子總數(shù)×100%。最終發(fā)芽率(Final Germination Rate, FGR)：豌豆種子在7 d內(nèi)的全部正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供測(cè)豆子總數(shù)×100%。

1.3.2 芽長 豌豆種子在30℃下浸種2 h，后30℃培養(yǎng)，分別隨機(jī)取出培養(yǎng)7 d的不同微波處理的豌豆芽30粒，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其平均芽長。

1.3.3 總黃酮和還原糖含量 不同微波處理的芽苗，在80℃，干燥2 h，至含水量達(dá)10%。后粉碎、過篩 (80目)，備用?？傸S酮含量測(cè)定，采用鋁鹽法[14]。還原糖含量的測(cè)定，參考趙凱等方法[15]。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量 樣品預(yù)處理：分別取發(fā)芽3 d、5 d和7 d的不同微波處理的豌豆芽苗，用吸水紙吸干表面水分后，稱重3 g，充分研磨 (加蒸餾水)，后轉(zhuǎn)移到離心管中，然后在4 000 r·min-1的離心機(jī)中離心20 min，將上清液定容至50 mL。參照高俊鳳主編《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》方法測(cè)定[16]。

1.3.5 過氧化氫酶活性 樣品預(yù)處理：分別取發(fā)芽3 d、5 d和7 d的不同微波處理的豌豆芽苗，用吸水紙吸干表面水分，稱重3 g，然后放進(jìn)研缽中加入3 mL pH值7.8的磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在冰浴上研磨成勻漿，再加入5 mL磷酸緩沖液研磨均勻，轉(zhuǎn)入25 mL的比色管中，并用緩沖溶液少量多次洗滌研缽，洗液并入比色管中，最后用緩沖液定容至刻度。搖勻后取約5 mL溶液于離心管中，采用冷凍離心機(jī)在4℃ 4 000 r·min-1下離心10 min，上清液即為過氧化氫酶提取液，轉(zhuǎn)入試管中保存于4℃的冰箱中備用。參照高俊鳳主編《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》方法測(cè)定[16]。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行One-way方差分析(ANOVA)；并用Duncan's復(fù)相關(guān)試驗(yàn)法進(jìn)行均值差異性的相關(guān)分析，顯著性水平P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對(duì)發(fā)芽率的影響

由圖1可知，培養(yǎng)1 d，微波100W10s處理的豌豆發(fā)芽率最高，達(dá)100%，比未經(jīng)微波處理的增加10.0%，而300W30s處理的發(fā)芽率最低，僅為71.33%，比未經(jīng)微波處理的低19.67%(P<0.05)。發(fā)芽7 d后，300W30s處理豌豆種子的最終發(fā)芽率最低，僅為 73.67%，比對(duì)照低21.67%。隨微波處理功率的增加，發(fā)芽率顯著降低 (P<0.05)。微波時(shí)間由10 s增加至30 s時(shí)，發(fā)芽率顯著降低(P<0.05)。

注：圖中小寫字母為相同時(shí)間下不同功率處理間(CK、100，200，300 W)顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。Note: Different lowercase letters in the figure are significantdifferences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.圖1 不同微波處理下豌豆種子發(fā)芽率和最終發(fā)芽率的變化Fig.1 Change of germination rate and final germination rate of pea seeds in different microwave treatment

2.2 微波處理對(duì)芽長的影響

從圖2可知，微波顯著影響了豌豆的芽長。微波處理10 s的種子，培育7 d時(shí)，芽長隨微波功率的增加而先升高后降低，而經(jīng)30 s處理者，其芽長隨微波功率增加而降低。200W10s微波處理的芽長比對(duì)照高12.31%，而300W30s處理的芽長比對(duì)照低37.70%(P<0.05)。

2.3 微波處理對(duì)芽苗蛋白質(zhì)含量的影響

經(jīng)微波處理后，發(fā)芽3 d (圖3A)時(shí)，豌豆芽苗蛋白質(zhì)的含量均高于對(duì)照組，其中300W30s處理達(dá)15.47 mg·100mg-1，比對(duì)照高21.11%。但發(fā)芽5 d (圖3B)時(shí)，蛋白質(zhì)含量要低于對(duì)照。在相同時(shí)間下，功率由100 W增至300 W，其蛋白質(zhì)的含量逐漸降低。發(fā)芽7 d (圖3C)時(shí)，微波300W30s下蛋白質(zhì)含量最低，為10.88 mg·100mg-1(P<0.05)。微波處理顯著影響豌豆萌發(fā)后的芽苗中蛋白質(zhì)的含量。

注：圖中小寫字母為相同時(shí)間下不同功率處理間(CK、100，200，300 W)顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。Note: Different lowercase letters in the figure are significantdifferences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.圖2 不同微波處理豌豆芽長的變化Fig.2 Change of shoot length of pea sprouts in differentmicrowave treatment

注：圖(A)、(B)和(C)分別為發(fā)芽3 d、5 d和7 d時(shí)的數(shù)據(jù)。圖中小寫字母為相同時(shí)間下不同功率處理間(CK、100，200，300 W)顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.圖3 不同微波處理下豌豆芽苗的蛋白質(zhì)含量的變化Fig.3 Change of protein content of pea sprouts in different microwave treatment

2.4 微波處理對(duì)芽苗CAT的影響

發(fā)芽3 d (圖4A)，不同微波處理對(duì)芽苗CAT的活性影響顯著(P<0.05)。300W30s處理下活性最高為1.23 mgH2O2·g-1FW·min-1，而100W30s處理的活性最低為0.39 mgH2O2·g-1FW·min-1。處理10s時(shí)，CAT活性隨微波功率的增加趨勢(shì)變化不大。發(fā)芽5 d (圖4B)時(shí)，微波的芽苗中，200W10s處理下的CAT活性最大為0.66 mgH2O2·g-1FW·min-1。當(dāng)時(shí)間為10 s和30 s時(shí)，CAT活性隨著微波功率的增加均呈先增加后降低趨勢(shì)。發(fā)芽7 d (圖4C)時(shí)，對(duì)照組的CAT的活性與微波處理的各組間差異顯著(P<0.05)。其中以300W30s的活性最高為0.88 mgH2O2·g-1FW·min-1，而300W10s處理者的活性值最低，為0.42 mgH2O2·g-1FW·min-1?？赡芤?yàn)楦邉┝块L時(shí)間微波處理對(duì)種子的影響較大，種子為適應(yīng)脅迫環(huán)境而激活了更多過氧化氫酶。

2.5 微波處理對(duì)芽苗還原糖含量的影響

發(fā)芽3 d (圖5A)時(shí)，微波處理豌豆的芽苗中還原糖的含量均高于對(duì)照組。300W10s處理的芽苗中還原糖含量最高，達(dá)10.11 mg·100mg-1。發(fā)芽5 d (圖5B)時(shí)，200W10s處理的芽苗中還原糖含量為5.17 mg·100mg-1，高于300W10s處理組。芽苗中還原糖含量隨微波功率的增加先升高后減低。發(fā)芽7 d (圖5C)時(shí)，100W30s處理后的種子的芽苗中還原糖含量最高，為4.56 mg·100mg-1，而300W30s處理者的含量最低，為1.47 mg·100mg-1。芽苗中還原糖含量隨微波功率的增加先增加后降低(P<0.05)，隨發(fā)芽時(shí)間增加逐漸降低。微波處理顯著影響豌豆芽苗中的還原糖含量，且發(fā)芽3 d到5 d時(shí)的還原糖含量變化較大。這種現(xiàn)象是由于還原糖在種子發(fā)芽的過程中只是一種過渡形式，在發(fā)芽的過程中會(huì)逐漸被胚所吸收，所以其整體呈逐漸降低趨勢(shì)。

2.6 微波處理對(duì)芽苗總黃酮含量的影響

從圖6A可知，發(fā)芽3 d時(shí)，處理10 s的豌豆種子，其芽苗的總黃酮含量隨微波功率的增加呈先升高后降低，100W10s處理時(shí)最大，而300W10s處理最低。處理30 s時(shí)，微波功率對(duì)豌豆芽苗中總黃酮的影響趨勢(shì)與之相同。200W30s處理下總黃酮含量為最高，達(dá)1.48 mg·100mg-1，而300W10s處理的含量最低，為0.96 mg·100mg-1。發(fā)芽5 d (圖6B)時(shí)，微波處理的芽苗的總黃酮含量低于對(duì)照組，其中300W10s的含量最低為0.93 mg·100mg-1。豌豆芽苗中的總黃酮含量隨微波功率的增加而逐漸減少。處理10 s與30 s間變化趨勢(shì)相同。發(fā)芽7 d (圖6C)時(shí)，微波處理過的芽苗中總黃酮含量顯著低于對(duì)照組，且其含量隨微波功率的增加而逐漸降低。

注：圖(A)、(B)和(C)分別為發(fā)芽3 d、5 d和7 d時(shí)的數(shù)據(jù)。圖中小寫字母為相同時(shí)間下不同功率處理間(CK、100，200，300 W)顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.圖4 不同微波處理的豌豆芽苗的CAT活性的變化Fig.4 Change of CAT activity of pea sprouts in differentmicrowave treatment

注：圖(A)、(B)和(C)分別為發(fā)芽3 d、5 d和7 d時(shí)的數(shù)據(jù)。圖中小寫字母為相同時(shí)間下不同功率處理間(CK、100，200，300 W)顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.圖5 不同微波處理下豌豆芽苗中還原糖含量的變化Fig.5 Change of reducing sugar of pea sprouts in different microwave treatment

注：圖(A)、(B)和(C)分別為發(fā)芽3 d、5 d和7 d時(shí)的數(shù)據(jù)。圖中小寫字母為相同時(shí)間下不同功率處理間(CK、100，200，300 W)顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.圖6 不同微波處理的豌豆芽苗的總黃酮含量的變化Fig.6 Change offavonoids content of pea sprouts in different microwave treatment

3 討 論

低功率短時(shí)間微波處理有利于豌豆種子的萌發(fā)，而高功率長時(shí)間則會(huì)抑制種子的萌發(fā)，降低發(fā)芽率、芽長，尤其是高功率長時(shí)間處理(圖2)。在同一時(shí)間下，發(fā)芽率和最終發(fā)芽率及芽長均隨微波功率增加而降低(圖1和圖2)。本研究結(jié)果與微波處理冬小麥的研究結(jié)果一致[12]。高功率長時(shí)間微波處理會(huì)顯著影響種子中酶的空間結(jié)構(gòu)，甚至起鈍化作用[17]。本研究中，微波處理后，芽苗中CAT活性隨微波功率增大和時(shí)間延長而增加(圖4)。植物在逆境脅迫下，通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，細(xì)胞產(chǎn)生快速感應(yīng)，進(jìn)而使相關(guān)酶的活性發(fā)生變化，同時(shí)，黃酮類化合物和脯氨酸(Pro)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加，以此適應(yīng)脅迫環(huán)境。本研究中豌豆芽苗中蛋白質(zhì)的含量隨微波功率的增加而降低(P<0.05)。發(fā)芽3～7d內(nèi)，相同功率和時(shí)間下，芽苗中蛋白質(zhì)含量隨發(fā)芽時(shí)間的增加而降低(圖3)。微波處理有利于豌豆芽苗生長前期組織內(nèi)蛋白質(zhì)的富集。但是在生長后期，各微波處理組中蛋白質(zhì)含量均降低且與功率增加和時(shí)間延長呈相反趨勢(shì)。可能因?yàn)槲⒉ㄌ幚韺?duì)種子形成了特殊的環(huán)境脅迫，導(dǎo)致種子需要消耗更多的蛋白質(zhì)去適應(yīng)生長環(huán)境[18]。不同處理時(shí)間(10 s和30 s)，豌豆苗中還原糖含量均隨微波功率的增加先增加后降低(圖5)。磁場(chǎng)等逆境脅迫可誘導(dǎo)苦蕎種子中PAL、CHI和FLS基因的表達(dá)，使萌發(fā)后的芽苗中總黃酮含量顯著增加[14]。在本研究中，微波處理的芽苗中總黃酮含量呈先增加后降低，發(fā)芽前期微波處理有利于總黃酮含量的增加。微波功率和處理時(shí)間均顯著影響豌豆芽苗中總黃酮的含量(圖6)。這說明微波處理不僅影響豌豆種子萌發(fā)，還對(duì)幼苗生長、生化代謝及生物量的積累產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

微波低功率短時(shí)間處理有利于豌豆種子的萌發(fā)，但大功率較長時(shí)間會(huì)造成發(fā)芽率降低。在相同的微波功率下，發(fā)芽率和最終發(fā)芽率受處理時(shí)間的影響較低。微波短時(shí)處理促進(jìn)種子的生長發(fā)育，芽長較長，而長時(shí)間處理則抑制生長。微波處理有利于豌豆芽苗中CAT活性增加和還原糖含量的積累，顯著影響芽中蛋白質(zhì)和總黃酮的含量，且微波處理有利于芽苗生長前期組織內(nèi)蛋白質(zhì)和總黃酮含量的富集。即微波處理不僅影響了種子萌發(fā)，還對(duì)幼苗生長、生化代謝及化學(xué)成分的積累產(chǎn)生影響。