王 卓，王湛博，程亞楠，尤淋君，楊 勇，王廣基

(1中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京211198；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210023；3中國(guó)藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，南京211198)

阿霉素作為臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛地用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤[1-2]，如白血病、淋巴瘤、胃癌、卵巢癌等，其抗瘤譜廣、抗瘤作用強(qiáng)、療效確切；但同時(shí)也會(huì)引起心臟毒性、骨髓抑制、脫發(fā)等不良反應(yīng)，而心臟毒性是其最嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此大大限制了其在臨床上的應(yīng)用[3-4]。近年來的研究顯示這種心臟毒性可能是由于阿霉素在藥物代謝過程中誘導(dǎo)了活性氧自由基的產(chǎn)生，而后者可通過線粒體依賴性的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起心肌細(xì)胞凋亡[5-6]。

右丙亞胺是目前市面上唯一一個(gè)用于預(yù)防蒽環(huán)類心臟毒性的藥品[7]。但其也會(huì)導(dǎo)致肝、腎功能功能異常等其他不良反應(yīng)，此外，有報(bào)道稱右丙亞胺會(huì)降低蒽環(huán)類藥物的抗腫瘤藥效，且價(jià)格昂貴，故也限制了其在臨床上的使用。

研究表明，五味子乙素作為五味子類中的主要有效成分，可以通過增強(qiáng)心肌抗氧化相關(guān)酶活力和上調(diào)谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)循環(huán)系統(tǒng)，及時(shí)清除小鼠活性氧的堆積，從而消除對(duì)心肌細(xì)胞的損傷[8-9]。此外其不良反應(yīng)小，價(jià)格低廉，又能逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)阿霉素的多藥耐藥性。因此，五味子乙素與阿霉素聯(lián)合用藥，可以有效的預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的急性心臟毒性，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

聯(lián)合用藥是臨床藥物治療的常用手段，可能會(huì)產(chǎn)生藥物之間相互作用，而體外的酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，五味子乙素可能存在潛在的肝藥酶誘導(dǎo)和抑制作用[10]。本研究建立優(yōu)化了LC-MS/MS法測(cè)定阿霉素及其主要代謝產(chǎn)物阿霉素醇，通過比較SD大鼠單獨(dú)給予阿霉素組和聯(lián)合給予五味子乙素和阿霉素組后阿霉素在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，初步考察兩者可能存在的藥代動(dòng)力學(xué)相互作用，以期為臨床安全合理用藥提供方法依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

五味子乙素(浙江鼎輝醫(yī)藥科技有限公司)；注射用鹽酸多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；阿霉素、阿霉素醇對(duì)照品(加拿大TRC公司)；柔紅霉素對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Merck公司)，水為自制純化水(美國(guó)Millipore公司)，其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

1290超高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；API 4000Q-Trap質(zhì)譜儀、AnalystTM色譜工作站(1.6.2版本，美國(guó)AB SCIEX公司)；天平(德國(guó)Sartorius公司)；離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

1.3 動(dòng) 物

Sprague Dawley大鼠，體重200 g左右，雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。

2 方 法

2.1 溶液的配制

阿霉素儲(chǔ)備液及工作溶液：分別精確稱取兩份適量阿霉素和阿霉素醇，置于試劑瓶中，加入甲醇充分溶解，分別配制成濃度為1.0 mg/mL的阿霉素和阿霉素醇儲(chǔ)備液，各2份，一份作為標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液，一份作為質(zhì)控樣品儲(chǔ)備液。用乙腈-水(1∶1)稀釋至質(zhì)量濃度為10/4、40/16、200/20、400/40、1 000/100、2 000/200、4 000/400和10 000/1 000 ng/mL的阿霉素和阿霉素醇的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。同法制備質(zhì)量濃度為10/4、20/8、200/20、1 600/160、8 000/800 ng/mL的阿霉素和阿霉素醇的混合質(zhì)控工作溶液。

內(nèi)標(biāo)柔紅霉素儲(chǔ)備液及工作溶液：精確稱取適量柔紅霉素，置于試劑瓶中，溶于甲醇中，充分溶解，配制成濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用乙腈稀釋至質(zhì)量濃度為50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

血漿樣品的制備：取標(biāo)曲工作溶液10 μL加入空白血漿190 μL得到混合好的標(biāo)曲樣品，即得血漿濃度為0.500/0.200、2.00/0.800、10.0/1.00、20.0/2.00、50.0/5.00、100/10.0、200/20.0和500/50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；取質(zhì)控工作溶液20 μL加入空白血漿380 μL得到混合好的質(zhì)控樣品，即得血漿濃度為0.500/0.200、1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL的質(zhì)控樣品。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。分析時(shí)間為4 min，采用梯度洗脫方式：0～3.5 min，5%～60% B；3.6～4.0 min，5% B。進(jìn)樣量：10 μL，流速：0.30 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣器溫度：6 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子方式檢測(cè)，掃描方式為選擇反應(yīng)檢測(cè)(SRM)；毛細(xì)管溫度：320 ℃；噴霧電壓：4 500 V；氣簾氣：25 psi(1 psi=6.895 kPa)；霧化器：45 psi；輔助氣：40 psi；用于定量分析的離子對(duì)分別為：m/z544.2→397.3(阿霉素，去簇電壓，80 V，碰撞電壓：15 V)、m/z546.2→399.2(阿霉素醇，去簇電壓，74 V，碰撞電壓：17 V)、m/z528.2→381.2(柔紅霉素，去簇電壓，74 V，碰撞電壓：15 V)。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品50 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液150 μL；2 000 r/min渦旋5 min使其充分混勻，4 ℃，15 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液100 μL到96孔板中，再加入純水100 μL充分混合搖勻后進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 考察6個(gè)不同來源的空白基質(zhì)。雙空白樣品在待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間附近，應(yīng)不出現(xiàn)顯著干擾。

2.4.2 線性關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)曲線將新鮮配制含8個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(2套)，一套標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品在一個(gè)分析批的開始時(shí)進(jìn)樣，另一套在結(jié)束時(shí)進(jìn)樣。8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度分別是：0.500/0.200、2.00/0.800、10.0/1.00、20.0/2.00、50.0/5.00、100/10.0、200/20.0和500/50.0 ng/mL。樣品按照“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行處理，使用權(quán)重因子(1/x2)，通過最小二乘法回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距，用于計(jì)算被分析物濃度。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度 使用新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品定量新鮮配制的質(zhì)控樣品(0.500/0.200、1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)，重復(fù)檢測(cè)(n=6)，通過計(jì)算檢測(cè)濃度的變異系數(shù)(%)考察批內(nèi)精密度，計(jì)算檢測(cè)濃度的平均值和標(biāo)定濃度的偏差(%)考察批內(nèi)準(zhǔn)確度。通過至少2 d，3個(gè)不同批次的質(zhì)控樣品并用3套獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算，評(píng)估批次間精密度和準(zhǔn)確度。每個(gè)批次質(zhì)控樣本需要新鮮配制(n=6)，配制濃度與進(jìn)行批內(nèi)檢測(cè)質(zhì)控樣品濃度相同。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 提取至少6份不同來源的SD大鼠血漿的空白基質(zhì)來考察基質(zhì)效應(yīng)。向空白基質(zhì)樣品添加化合物和內(nèi)標(biāo)使其最終濃度分別與質(zhì)控樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)的進(jìn)樣濃度一致；配制含有同樣濃度化合物和內(nèi)標(biāo)的參比溶液。通過分別比較基質(zhì)樣品和參比溶液中化合物和內(nèi)標(biāo)峰峰面積計(jì)算化合物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)(MF)。內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)(IS-normalized matrix factor)將通過化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。該專題將采用內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)方案

動(dòng)物試驗(yàn)部分經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。12只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成兩組。組1(阿霉素組)：靜脈注射5 mg/kg 的阿霉素；組2(五味子乙素+阿霉素組)：連續(xù)灌胃給予五味子乙素20 mg/kg 7 d后，于第7天灌胃給予五味子乙素20 mg/kg后2 h靜脈注射5 mg/kg的阿霉素。采血時(shí)間點(diǎn)：分別于給藥前、給藥后5、30 min和1、2、4、6、8、10、24、48、72 h眼眶靜脈叢采血0.3 mL，EDTA-K2抗凝，4 ℃，1 500 r/min離心5 min，分離上層血漿，于-70 ℃冰箱中保存，待測(cè)。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 本實(shí)驗(yàn)建立了SD大鼠血漿中阿霉素及其代謝產(chǎn)物阿霉素醇的LC-MS/MS檢測(cè)方法。如圖1所示，該分析方法具有良好的選擇性，SD大鼠空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾受試物阿霉素和阿霉素醇的測(cè)定。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以待測(cè)物血漿終濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行最小二乘法(權(quán)重系數(shù)為1/x2)回歸計(jì)算，求得阿霉素和阿霉素醇在SD大鼠血漿中的線性回歸方程。結(jié)果表明阿霉素在0.5～500 ng/mL，阿霉素醇在0.2～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本法SD大鼠血漿中阿霉素和阿霉素醇的定量下限(LLOQ)分別為0.5和0.2 ng/mL。

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 質(zhì)控樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00、400/40.0 ng/mL)，每個(gè)濃度各制備6個(gè)樣進(jìn)行分析。連續(xù)3個(gè)分析批按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理。結(jié)果見表1，該方法測(cè)定阿霉素和阿霉素醇的精密度均小于15%，準(zhǔn)確度均在(100±15)%以內(nèi)，結(jié)果符合要求。

Figure1 Chromatograms of blank plasma(A) and plasma sample obtained after intravenous injection of doxorubicin(B)

Table1 Inter-and intra-batch precision and accuracy of doxorubicin and doxorubicinol

Analytec/(ng/mL)Accuracy/%Inter-batchIntra-batchRSD/%Inter-batchInter-batchDoxorubicin0.500109.599.611.49.51.00102.5102.67.72.210.095.693.03.73.180.097.093.53.13.840094.192.71.41.5Doxorubicinol0.200112.399.812.011.20.400103.7100.913.83.41.00104.199.86.23.78.00101.2100.73.52.740.098.299.52.72.1

3.1.4 基質(zhì)效應(yīng) 取6個(gè)不同來源的SD大鼠血漿，每個(gè)來源的血漿各制備4個(gè)濃度的樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)，按“2.3”項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析，考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表2，阿霉素的基質(zhì)效應(yīng)在117.7%～131.7%之間，總體變異系數(shù)為5.1%；阿霉素醇的基質(zhì)效應(yīng)在113.0%～124.2%之間，總體變異系數(shù)為6.6%。阿霉素和阿霉素醇的各濃度水平在SD大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)保持一致。

3.1.4 提取回收率 制備質(zhì)控血漿樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)，按“2.3”項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析，考察提取回收率。結(jié)果見表2，阿霉素的提取回收率在88.2%～95.7%之間，總體變異系數(shù)為4.1%；阿霉素醇的提取回收率在88.8%～101.1%之間，總體變異系數(shù)為6.2%。阿霉素和阿霉素醇的各濃度水平在SD大鼠血漿中的提取回收率保持一致。

Table2 Matrix effect (ME) and recovery (REC) of doxorubicin and doxorubicinol

Analytec/(ng/mL)Matrix effectME/%RSD/%RecoveryREC/%RSD/%Doxorubicin1.00117.75.195.74.110.0130.388.380.0131.788.5400125.588.2Doxorubicinol0.400115.86.6101.16.21.00113.090.78.00124.289.940.0116.888.8

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

阿霉素單獨(dú)靜脈注射和聯(lián)合五味子乙素給藥后，阿霉素及其主要代謝產(chǎn)物阿霉素醇的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。利用SPSS 20.0軟件，對(duì)兩組血漿中阿霉素和阿霉素醇的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，AUC0-t、AUC0-∞和cmax經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，其余參數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P均大于0.05，結(jié)果見表4。結(jié)果表面阿霉素在單次給藥組和聯(lián)合給藥組中SD大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒有顯著性差異，聯(lián)合用藥后阿霉素的藥代動(dòng)力學(xué)行為未發(fā)生顯著變化。

Table3 Pharmacokinetic parameters of doxorubicin and doxorubicinol

AnalyteGroupAUC0-t/(ng·h/mL)AUC0-∞/(ng·h/mL)t1/2/hcmax/(ng/mL)DoxorubicinGroup 1605.69±145.84665.77±158.4831.88±17.172 786.00±321.14Group 2564.53±23.99643.39±31.4942.20±9.952 060.00±136.75DoxorubicinolGroup 126.69±13.4149.97±32.5566.64±52.229.69±2.06Group 229.00±2.7854.94±14.3984.79±36.257.25±2.51

Table4 Statistical analysis results of doxorubicin and doxorubicinol

Pharmacokinetic parameterP valueDoxorubicinDoxorubicinolcmax0.1090.119AUC0-t0.1030.500AUC0-∞0.6800.441tmax1.0000.538t1/20.9540.541CL0.7830.382Vd0.2560.146

4 討 論

隨著中藥的廣泛應(yīng)用，越來越多的患者把中藥補(bǔ)充劑結(jié)合西藥作為治療方案的一部分，中藥-西藥相互作用問題日益凸顯。代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體是影響藥物體內(nèi)處置過程的重要因素，代謝酶承擔(dān)藥物的代謝清除，主要包括細(xì)胞色素P450超家族(CYP)、UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)以及磺酸化酶(SULT)；轉(zhuǎn)運(yùn)體參與藥物的口服吸收、體內(nèi)分布以及排泄，主要包括腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體、腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體、肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體以及腦轉(zhuǎn)運(yùn)體等。中藥-西藥的聯(lián)合用藥可能導(dǎo)致代謝酶表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的改變，從而使血漿或特定組織中藥物濃度的變化，進(jìn)而改變藥物治療效果和安全性，是藥物相互作用的主要靶點(diǎn)。

體外的相互作用研究表明，五味子乙素可能對(duì)代謝酶產(chǎn)生誘導(dǎo)和抑制作用。本研究主要采用體內(nèi)手段研究藥物-藥物相互作用，以阿霉素及其主要代謝產(chǎn)物阿霉素醇為研究對(duì)象，首先建立了LC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)SD大鼠血漿中阿霉素和阿霉素醇的檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證和評(píng)估。其次合理安排實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，采用經(jīng)過驗(yàn)證的LC-MS/MS方法對(duì)單獨(dú)給予阿霉素組和五味子乙素聯(lián)合阿霉素給藥組的SD大鼠藥代動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行研究，比較兩者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿霉素在單次給藥組和聯(lián)合給藥組中SD大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒有顯著性差異，聯(lián)合用藥后阿霉素的藥代動(dòng)力學(xué)行為未發(fā)生顯著變化。