馬景蕃，張 燕，葉甘萍，韋啟良，邱龍新*

(1龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012；2預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364012；3福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364012)

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌嚴(yán)重威脅著廣大育齡婦女的健康和生命，它是婦女第二常見的惡性腫瘤，同時(shí)也是婦女發(fā)病和死亡的主要原因之一，近幾年其發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。目前，化療是宮頸癌患者主要治療手段之一，但在臨床上化療產(chǎn)生的耐藥使得宮頸癌治療失效和復(fù)發(fā)，如何克服宮頸癌化療耐藥是其治療面臨的一大挑戰(zhàn)[2]。

自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種現(xiàn)象，諸多研究表明[3]，自噬是一把雙刃劍：一方面，細(xì)胞通過自噬可以實(shí)現(xiàn)代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，起到細(xì)胞保護(hù)作用；另一方面，自噬也可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。隨著人們對(duì)自噬作用及其調(diào)控機(jī)制的深入研究，很多證據(jù)表明[4]，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤治療中起著重要作用。

千里光菲靈堿(seneciphylline，SENE)是一種來源于菊科植物[Gynurasegetum(Lour) Merr]根部的生物堿[5]，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)千里光菲靈堿的抗腫瘤作用較為關(guān)注，研究表明千里光菲靈堿能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[6]，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。本研究采用熒光共定位、Western blot等研究方法，觀察千里光菲靈堿對(duì)宮頸癌HeLa、Caski細(xì)胞的影響，并探討其可能機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均(美國Hyclone 公司)；千里光菲靈堿[成都德思特生物技術(shù)有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解]；MTT試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine?3000、Lysotraker Red(美國Invitrogen公司)；海藻糖(trehalose，Tre)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3MA)、氯喹(chloroquine，CQ)、U0126(上海Sigma-Aldrich公司)。LC3抗體(美國Novus公司)；GAPDH抗體(美國Millipore Chemicon公司)；p62抗體(美國Santa Cruz公司)；P-ERKl/2(Thr202/Thr 204)及T-ERKl/2抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

酶標(biāo)儀Elx-800型(美國Bake公司)；CFM-550倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)；Versa MAXTM多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.3 細(xì)胞株

人宮頸癌HeLa、Caski細(xì)胞株購于ATCC，用含10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素(各100 U/mL)的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5%CO2的飽和濕度條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng) 物

25只雄性BALB/c裸鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005，體質(zhì)量18～20 g。

2 方 法

2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖

將HeLa、Caski細(xì)胞分別接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升6×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組不加千里光菲靈堿，實(shí)驗(yàn)組用濃度為25、50、100、200、400、800、1 000 μmol/L的千里光菲靈堿分別處理細(xì)胞24、48、72 h，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后加入5 mg/mL MTT液20 μL，在37 ℃避光培養(yǎng)箱孵育4 h后吸去上清液，再每孔中加入DMSO 120 μL，搖床輕微振蕩15 min，用酶標(biāo)儀于570 nm處測量各孔的吸收度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(藥物組吸收度/對(duì)照組吸收度)×100。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察

根據(jù)Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系分別轉(zhuǎn)入到HeLa、Caski細(xì)胞中，使用G418篩選出具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa、Caski細(xì)胞。將生長狀態(tài)良好的GFP-LC3/HeLa、GFP-LC3/Caski細(xì)胞接種到24孔板中，接種密度為每孔3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)20 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理，處理結(jié)束后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP聚集的產(chǎn)生情況并進(jìn)行圖片采集。

2.3 Lysotraker Red染色

用100 mol/L海藻糖(Tre)和250 μmol/L千里光菲靈堿分別處理GFP-LC3/HeLa、GFP-LC3/Caski細(xì)胞24 h后，加入75 nmol/L的 Lysotraker Red染色25 min，棄去上清液，經(jīng)PBS洗滌后，倒置熒光顯微鏡觀察染色情況并拍照。

2.4 Western blot分析

將對(duì)數(shù)生長期的HeLa、Caski細(xì)胞接種于6孔板中，處理結(jié)束后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，各組取蛋白樣品30 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于室溫下封閉1.5 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

2.5 裸鼠皮下移植瘤模型建立及抑制實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長期的HeLa、Caski細(xì)胞以每只1×107個(gè)細(xì)胞的注射量分別接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。當(dāng)瘤體積達(dá)200 mm3時(shí)進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)。將25只荷瘤鼠均分為5組：對(duì)照組(生理鹽水組)、HeLa細(xì)胞低劑量組(1 mg/kg)、HeLa細(xì)胞高劑量組(5 mg/kg)、Caski細(xì)胞低劑量組(1 mg/kg)、Caski細(xì)胞高劑量組(5 mg/kg)。隔日灌胃，共14 d。每日觀察荷瘤裸鼠的一般狀況及皮下移植瘤的生長狀態(tài)。瘤體積(mm3)=1/2長×寬2，抑制率(%)=(Vc-Vt)/Vc×100，其中Vc為對(duì)照組平均瘤體積，Vt為各實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié) 果

3.1 千里光菲靈堿對(duì)HeLa、Caski細(xì)胞增殖的影響

圖1結(jié)果顯示，不同濃度的千里光菲靈堿分別處理HeLa、Caski細(xì)胞24、48、72 h后，千里光菲靈堿對(duì)兩種宮頸癌細(xì)胞增殖抑制作用均呈時(shí)間、劑量依賴性。圖1-A顯示，當(dāng)處理時(shí)間為24、48、72 h，千里光菲靈堿濃度分別為200、100、50 μmol/L時(shí)HeLa細(xì)胞存活率與對(duì)照組均呈顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的IC50分別為882.8、494.2、330.6 μmol/L；圖1-B顯示，當(dāng)處理時(shí)間為24、48、72 h，千里光菲靈堿濃度分別為400、200、100 μmol/L時(shí)Caski細(xì)胞存活率與對(duì)照組均呈顯著性差異(P<0.05)。Caski細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的IC50分別為923.3、646.5、457.6 μmol/L。

3.2 千里光菲靈堿誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬

GFP-LC3/HeLa、GFP-LC3/Caski是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并持續(xù)表達(dá)綠色熒光標(biāo)簽的人宮頸癌細(xì)胞系，當(dāng)自噬被激活后，GFP-LC3-I就會(huì)被加工成GFP-LC3-II，聚集在自噬小體膜中，在熒光顯微鏡下，能夠觀測到具有綠色熒光的點(diǎn)狀聚集(自噬體)。圖2-A，D顯示，分別處理GFP-LC3/HeLa、GFP-LC3/Caski細(xì)胞24 h后，對(duì)照DMSO組均不能引起兩種人宮頸癌細(xì)胞中出現(xiàn)GFP的點(diǎn)狀聚集，而經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑海藻糖(Tre)組出現(xiàn)了明顯的GFP點(diǎn)狀聚集；用不同濃度的千里光菲靈堿處理兩種細(xì)胞24 h后，出現(xiàn)的綠色熒光點(diǎn)狀聚集均呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，即隨千里光菲靈堿處理濃度的增加，綠色熒光點(diǎn)狀聚集陽性細(xì)胞的比例增多。以上結(jié)果表明千里光菲靈堿可能誘導(dǎo)了HeLa及Caski細(xì)胞發(fā)生自噬。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

為了進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果，用Western blot分析了自噬相關(guān)蛋白(LC3和P62)的表達(dá)情況。如圖2-B所示，不同濃度的千里光菲靈堿處理HeLa細(xì)胞24 h后，經(jīng)藥物處理(200、400、800 μmol/L)的HeLa細(xì)胞與對(duì)照(0 μmol/L)相比，其P62/GAPDH比值顯著降低，且呈濃度依賴性，而LC3-II/LC3-I比值顯著提高，亦呈濃度依賴性；200 μmol/L的藥物處理Caski細(xì)胞24 h后，其P62/GAPDH比值及LC3-II/LC3-I比值與對(duì)照(0 μmol/L)相比無顯著性差異，而400和800 μmol/L的藥物處理Caski細(xì)胞24 h后，其P62/GAPDH比值與對(duì)照(0 μmol/L)相比顯著降低，且呈濃度依賴性，而LC3-II/LC3-I比值顯著提高，亦呈濃度依賴性(圖2-E)。另外，400 μmol/L的千里光菲靈堿分別處理HeLa及Caski細(xì)胞不同時(shí)間后，P62/GAPDH比值和LC3-II/LC3-I比值與藥物處理呈時(shí)間依賴性(圖2-C，F(xiàn))。以上結(jié)果均表明千里光菲靈堿能誘導(dǎo)宮頸癌HeLa及Caski細(xì)胞發(fā)生自噬。

3.3 千里光菲靈堿誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生完整自噬流

將千里光菲靈堿(400 μmol/L)與飽和濃度的自噬的下游抑制劑氯喹(CQ，50 μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合處理HeLa及Caski細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，氯喹單獨(dú)處理組在兩種細(xì)胞中均出現(xiàn)了顯著的P62及LC3-II的累積，說明氯喹阻斷了HeLa及Caski細(xì)胞自噬下游底物的降解。與單獨(dú)千里光菲靈堿處理組相比，千里光菲靈堿聯(lián)合氯喹處理組在兩種細(xì)胞中具有顯著的LC3-II及P62的蛋白累積(圖3-A,C)，這說明千里光菲靈堿并沒有阻斷自噬下游底物的降解。

隨后，進(jìn)一步用熒光共定位方法進(jìn)行驗(yàn)證，Lysotraker Red是一種細(xì)胞堿性染料，它可以選擇性地給細(xì)胞內(nèi)部的溶酶體染色，同時(shí)亦可指示溶酶體的合成及活性[7]。如圖3-B，D顯示，用100 mmol/L海藻糖和400 μmol/L千里光菲靈堿分別處理GFP-LC3/HeLa和GFP-LC3/Caski細(xì)胞24 h，千里光菲靈堿與陽性對(duì)照海藻糖一樣，均能夠誘導(dǎo)HeLa 和Caski細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)聚集(自噬體)，且這些熒光點(diǎn)聚集可與Lysotraker Red染色的溶酶體實(shí)現(xiàn)共定位。這進(jìn)一步說明了千里光菲靈堿不會(huì)干擾自噬體與溶酶體的融合。

3.4 抑制自噬增強(qiáng)千里光菲靈堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用

自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有雙重作用，為明確千里光菲靈堿誘導(dǎo)的自噬與宮頸癌細(xì)胞增殖的關(guān)系，將自噬抑制劑與千里光菲靈堿聯(lián)合作用于HeLa和Caski細(xì)胞。3-甲基腺嘌呤(3MA)是一種通過抑制Ⅲ型PI3K復(fù)合物的自噬上游抑制劑[8]。將千里光菲靈堿(400 μmol/L)與自噬抑制劑3MA(5 mmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合處理HeLa及Caski細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，3MA單獨(dú)處理組在兩種細(xì)胞中均出現(xiàn)了顯著的LC3-II的累積，說明3MA阻止了HeLa和Caski細(xì)胞自噬的發(fā)生。與單獨(dú)千里光菲靈堿處理組相比，千里光菲靈堿聯(lián)合3MA處理組在兩種細(xì)胞中均具有更高的LC3-II/LC3-I比值，呈極顯著性差異(圖4-A，C)。兩種細(xì)胞活力檢測(圖4-B，D)表明，與單獨(dú)千里光菲靈堿處理組相比，千里光菲靈堿聯(lián)合3MA處理組顯著抑制了兩種細(xì)胞的增殖。

A:Green fluorescence puncta in HeLa cells；B&C:Autophagy related protein expression level in HeLa cells；D:Green fluorescence puncta in Caski cells；E&F:Autophagy related protein expression level in Caski cells

Tre:Trehalose (100 mmol/L)；SENE:Seneciphylline.Scale bar=20 μm

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

A:Autophagy related protein expression level in HeLa cells；B:Co-localizations between the GFP-LC3 dots and Lysotracker Red in HeLa cells；C:Autophagy related protein expression level in Caski cells；D:Co-localizations between the GFP-LC3 dots and Lysotracker Red in Caski cells

Scale bar=20 μm

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsSENE group

A:Autophagy related protein expression level in HeLa cells；B:HeLa cells viability；C:Autophagy related protein expression level in Caski cells；D:Caski cells viability

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsSENE group

3.5 千里光菲靈堿誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞自噬依賴于MEK/ERK1/2途徑

為明確千里光菲靈堿誘導(dǎo)的自噬是否激活MEK/ERK1/2途徑，進(jìn)行Western bolt實(shí)驗(yàn)和免疫熒光檢測。U0126和PD98059是MEK特異性的磷酸化抑制劑，而MEK的活性抑制將直接導(dǎo)致ERK的活性抑制[9]。將千里光菲靈堿(400 μmol/L)與U0126(10 mmol/L)/PD98059(50 mmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合處理HeLa或Caski細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，單獨(dú)千里光菲靈堿處理組在兩種細(xì)胞中均出現(xiàn)了顯著的P-ERK1/2蛋白累積，即千里光菲靈堿誘導(dǎo)了ERK的活化。而與單獨(dú)千里光菲靈堿處理組相比，千里光菲靈堿聯(lián)合U0126/ PD98059處理組在兩種宮頸癌細(xì)胞中均抑制了千里光菲靈堿誘導(dǎo)的ERK活化，兩組呈極顯著性差異，而HeLa及Caski細(xì)胞內(nèi)部總ERK蛋白含量沒有明顯變化(圖5-A，B，D，E)；同時(shí)，圖5-C，F(xiàn)表明，U0126/PD98059抑制了千里光菲靈堿在兩種細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬體形成。綜上，千里光菲靈堿誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬激活了MEK/ERK1/2途徑。

A&B:ERK protein expression level in HeLa cells；C:Green fluorescence puncta in HeLa cells；D&E:ERK protein expression level in Caski cells；

F:Green fluorescence puncta in Caski cells

Scale bar=20 μm

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsSENE group

3.6 千里光菲靈堿對(duì)荷瘤鼠移植瘤生長的抑制作用

如圖6所示，各處理荷瘤鼠腫瘤體積均顯著小于對(duì)照組的瘤體積，接種HeLa細(xì)胞并灌胃千里光菲靈堿低劑量組(1 mg/kg)的抑瘤率為22.97%，接種HeLa細(xì)胞并灌胃千里光菲靈堿高劑量組(5 mg/kg)的抑瘤率為33.22%，接種Caski細(xì)胞并灌胃千里光菲靈堿低劑量組(1 mg/kg)的抑瘤率為18.37%，接種Caski細(xì)胞并灌胃千里光菲靈堿高劑量組(5 mg/kg)的抑瘤率為27.68%。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

4 討 論

傳統(tǒng)中藥活性物質(zhì)的抗腫瘤研究越來越受到研究學(xué)者們的關(guān)注。本研究表明，千里光菲靈堿可以抑制人宮頸癌HeLa及Caski細(xì)胞的增殖，且其抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性。因?qū)罄m(xù)細(xì)胞自噬及其機(jī)制研究均需細(xì)胞具有一定活力，故本研究根據(jù)千里光菲靈堿對(duì)兩種細(xì)胞作用24 h的IC50，選取了200、400、800 μmol/L 3個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

自噬是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的一種自我保護(hù)過程，其在維持細(xì)胞發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，很多抗腫瘤藥物如麥冬皂苷B[10]、鹽酸青藤堿[11]等可以不同程度地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。Liu等[6]研究表明，千里光菲靈堿可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但其是否能誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬及其機(jī)制尚無報(bào)道。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自噬被激活后，微管相關(guān)蛋白LC3-I就會(huì)被加工成LC3-II，并最終被溶酶體融合降解，P62蛋白可與微管相關(guān)蛋白LC3結(jié)合并被降解[12]。因此，二者常被選作細(xì)胞發(fā)生自噬的標(biāo)志蛋白。本研究結(jié)果顯示，千里光菲靈堿處理HeLa及Caski細(xì)胞后，出現(xiàn)了明顯的GFP點(diǎn)狀聚集，另外，Western blot實(shí)驗(yàn)表明，千里光菲靈堿可以促進(jìn)LC3-I向LC3-II蛋白轉(zhuǎn)換，同時(shí)，P62蛋白累積減少。這些結(jié)果均表明千里光菲靈堿誘導(dǎo)HeLa及Caski細(xì)胞發(fā)生了自噬。

自噬是一個(gè)完整的過程，包括雙層分隔膜的產(chǎn)生，雙層分隔膜包裹待降解物形成自噬體，自噬體與溶酶體融合，降解自噬底物。當(dāng)自噬性降解被抑制，如自噬體與溶酶體融合被阻或溶酶體功能受損，均可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。因此，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的GFP點(diǎn)狀聚集、LC3-II蛋白的累積并不能說明細(xì)胞是否發(fā)生了完整自噬。氯喹是細(xì)胞發(fā)生自噬的下游抑制劑，主要通過改變?nèi)苊阁w的pH，阻斷自噬體與溶酶體的融合從而阻止自噬底物的降解，飽和濃度的氯喹(50 μmol/L)可以完全抑制自噬底物的降解[13]。本研究的研究結(jié)果表明，在飽和濃度的氯喹完全抑制自噬的同時(shí)，千里光菲靈堿可進(jìn)一步促進(jìn)P62和LC3-II蛋白在HeLa及Caski細(xì)胞內(nèi)的累積。此外，熒光共定位實(shí)驗(yàn)表明，千里光菲靈堿誘導(dǎo)的GFP點(diǎn)聚集可與LysotrakerRed染色的溶酶體實(shí)現(xiàn)共定位，表明了自噬體與溶酶體融合形成了自噬溶酶體。因此，本研究認(rèn)為千里光菲靈堿可誘導(dǎo)HeLa及Caski兩種宮頸癌細(xì)胞發(fā)生完整的自噬流。

自噬是一種高度動(dòng)態(tài)的過程，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有兩面性。為了明確千里光菲靈堿誘導(dǎo)的自噬是導(dǎo)致自噬性死亡還是導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)千里光菲靈堿的耐藥性增加，本研究使用了自噬抑制劑3MA，3MA是一種蛋白激酶抑制劑，它主要作用于細(xì)胞內(nèi)的Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，而PI3K是激活自噬上游一種重要的激酶，最近許多研究者[14]發(fā)現(xiàn)其與抗腫瘤藥物聯(lián)合作用可增加藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性。本研究的研究結(jié)果表明，3MA可促進(jìn)LC3-II蛋白在HeLa及Caski細(xì)胞內(nèi)的累積，同時(shí)，千里光菲靈堿聯(lián)合3MA具有更為顯著的LC3-II蛋白累積。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，自噬上游抑制劑3MA提高了千里光菲靈堿對(duì)HeLa及Caski細(xì)胞增殖的抑制作用。表明自噬導(dǎo)致了宮頸癌細(xì)胞對(duì)千里光菲靈堿的抗腫瘤作用降低，自噬阻斷可使千里光菲靈堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用增加，這與大多數(shù)中藥活性成分抗腫瘤研究相一致[15]，即自噬減弱了抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用，使得藥物的耐藥性增加，抑制自噬可以提高藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，增加對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)，可以感知細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)刺激，其與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)分化等現(xiàn)象關(guān)系密切[16-17]。眾多研究結(jié)果顯示，ERK信號(hào)途徑參與對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步明確千里光菲靈堿誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬的分子機(jī)制，本研究對(duì)MEK/ERK1/2信號(hào)途徑中的關(guān)鍵蛋白ERK進(jìn)行了研究。結(jié)果表明千里光菲靈堿誘導(dǎo)的HeLa及Caski細(xì)胞自噬激活了MEK/ERK1/2途徑。另外，抑制自噬提高千里光菲靈堿對(duì)HeLa及Caski細(xì)胞的抗腫瘤效果是否與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)還需做進(jìn)一步研究。本研究選用宮頸癌HeLa及Caski細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)一步探討千里光菲靈堿對(duì)移植瘤生長的抑制作用。結(jié)果表明，千里光菲靈堿的高劑量組(5 mg/kg)的抑瘤效果最好。

綜上所述，千里光菲靈堿可以抑制人宮頸癌HeLa、Caski細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)完整的自噬流，抑制細(xì)胞自噬可增強(qiáng)千里光菲靈堿的抗腫瘤作用，千里光菲靈堿誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞自噬激活了MEK/ERK1/2信號(hào)通路，千里光菲靈堿可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長，這為千里光菲靈堿對(duì)人宮頸癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。