王夏英，邱梁楨，李青卓，徐 偉，王曉穎

(福建中醫(yī)藥大學，福州 350122)

聚合物膠束作為一種納米藥物載體，近年來受到廣泛的關(guān)注。聚合物膠束的疏水內(nèi)核可作為疏水性藥物的存儲空間，將難溶性藥物包載于其中；其親水性外殼能提高膠束在水溶液中的穩(wěn)定性，并能保護膠束，避免其在體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別而被快速清除[1-3]。聚合物膠束粒徑較小，能通過增強滲透滯留效應(yīng)(EPR)提高抗腫瘤藥物向腫瘤部位遞送的效果[4-5]。

羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)為殼聚糖水溶性衍生物，具有良好的生物相容性，生物活性，抗菌活性及穩(wěn)定性。CMCS上具有多種官能團，例如-NH2和-COOH，具有良好的可修飾性。因此，CMCS作為藥物載體被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[6-7]。大黃酸(rhein，R)為中藥大黃的主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤細胞增殖、抗腫瘤血管生成等作用[8-9]，并與抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)具有協(xié)同抗腫瘤作用[10]。

聚乙二醇(PEG)由重復的氧乙烯基組成，其具有高度的親水性。研究人員于上世紀70年代首次提出將PEG用于藥物的修飾[11]。經(jīng)PEG化的藥物能增加水溶性，降低酶降解和腎小球濾過率，下調(diào)免疫原性或抗原性，保護其免遭體內(nèi)環(huán)境破壞[12-15]。目前，許多PEG化的化療制劑已被FDA批準上市[16-18]。

本研究以PEG修飾的羧甲基殼聚糖為骨架，接枝小分子大黃酸合成兩親性mPEG-羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物(CRmP偶聯(lián)物)作為藥物遞送載體材料，并制備了載抗腫瘤藥物PTX的CRmP納米膠束(PTX/CRmP納米膠束)，該膠束能增加PTX的水溶性，并提高PTX抗腫瘤的效果。

1 材 料

1.1 試 劑

O-羧甲基殼聚糖(相對分子質(zhì)量1×105，青島弘海生物技術(shù)有限公司)；大黃酸(陜西澳源生物技術(shù)有限公司，純度≥98%)；紫杉醇(上海中西三維藥業(yè)有限公司)；透析袋(MWCO14000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，純度≥98%)；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，純度≥98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；羧基化聚乙二醇單甲醚(mPEG-COOH，相對分子質(zhì)量2 000，純度≥98%，上海金穗生物科技有限公司)；RPMI Medium Modified，磷酸鹽緩沖液(1×)，0.25%胰蛋白酶(1×)，青霉素鏈霉素溶液(美國HyClone公司)。

1.2 儀 器

MS105DU十萬分之一電子天平[特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Alpha1-2 LD冷凍干燥機(德國Christ公司)；NICOMPTM380ZLS激光粒徑測定儀(美國Santa Bbarbara公司)；Avance III 500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；原子力顯微鏡5500(美國Agilent公司)；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Infinite M200 PRO多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

2 方 法

2.1 PEG修飾的羧甲基殼聚糖-大黃酸(CRmP)偶聯(lián)物的合成

稱取適量的CMCS置反應(yīng)瓶中，加入蒸餾水10 mL溶脹30 min。取反應(yīng)量的大黃酸置廣口瓶中，加入1%NaHCO3溶液10 mL，加熱使溶解，冷卻至室溫。取反應(yīng)量的mPEG-COOH粉末置廣口瓶中，加入蒸餾水5 mL溶解。將mPEG-COOH溶液加入到已冷卻至室溫的大黃酸溶液中，加入EDC·HCl，活化20 min，再加入NHS，將此混合液攪拌下加入CMCS溶液中，避光攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮沉淀反應(yīng)物，靜置后抽濾(0.45 μm的濾膜)。將抽干后的反應(yīng)產(chǎn)物溶解于水中，冰水浴條件下探頭超聲至澄清后過0.8 μm的濾膜，濾液轉(zhuǎn)置于透析袋中透析3 d。

透析結(jié)束后，將產(chǎn)物水溶液再次在冰水浴條件下探頭超聲20 min后，取上清液過膜(0.8 μm)，濾液-20 ℃冰箱預凍，冷凍干燥，即得CRmP偶聯(lián)物。

2.2 CRmP偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紅外光譜(FT-IR)表征 采用溴化鉀(KBr)壓片法。取適量CMCS、大黃酸、mPEG-COOH、CRmP偶聯(lián)物，分別加適量KBr，于紅外燈下研磨混合，壓片，進行紅外檢測，記錄FT-IR光譜。

2.2.2 核磁共振氫譜(1H NMR)表征 分別稱取CMCS、mPEG-COOH和CRmP偶聯(lián)物各10 mg，CMCS、mPEG-COOH以D2O為溶劑，CRmP偶聯(lián)物以D2O-DMSOd6，1∶1比例為溶劑，溶解后加入核磁管中，四甲基硅烷為內(nèi)標，采用核磁共振儀測定樣品的1H NMR。

2.3 取代度的測定

2.3.1 大黃酸取代度的測定 CRmP偶聯(lián)物上大黃酸的取代度采用紫外分光光度法測定。精密稱取大黃酸對照品適量，以甲醇為溶劑配制系列濃度，于229 nm波長處檢測，繪制大黃酸的標準曲線。將供試品溶液所測的吸收度，代入標準曲線中，得到大黃酸的濃度，根據(jù)公式(1)計算大黃酸在CRmP偶聯(lián)物上的取代度(DSR)：

(1)

式中，mR為大黃酸接枝在CRmP偶聯(lián)物上的量(g)；mCRmP為測定時所稱取的CRmP偶聯(lián)物的量(g)。

2.3.2 mPEG-COOH取代度的測定 mPEG-COOH取代度通過1H NMR譜計算而得。CRmP偶聯(lián)物完成1H NMR譜圖分析后，根據(jù)特征峰峰面積的比值計算得到mPEG-COOH的取代度。

2.4 PTX/CRmP納米膠束的制備

稱取CRmP偶聯(lián)物18 mg，加蒸餾水適量，室溫下攪拌溶解后冰水浴探頭超聲10 min，將PTX溶于無水乙醇中，然后逐滴加至CRmP納米膠束溶液中，劇烈攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，透析24 h后，冰水浴探頭超聲20 min后用0.8 μm濾膜濾過，即得PTX/CRmP納米膠束溶液，凍干后得PTX/CRmP納米膠束凍干粉末。

2.5 PTX/CRmP納米膠束載藥量和包封率的測定

2.5.1 色譜條件的建立 色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(69∶31)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為227 nm，進樣量為20 μL。

2.5.2 標準曲線的制備 取PTX 3 mg，精密稱定，置10 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為307 μg/mL的儲備液。取此儲備液，以甲醇為溶劑，逐步稀釋配制質(zhì)量濃度分別為92.1,61.4、30.7,24.56,15.35,2.456,1.535 μg/mL的PTX溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，繪制標準曲線，

2.5.3 測定方法 精密稱定適量的PTX/CRmP納米膠束凍干粉末，加水溶解，0.8 μm濾膜濾過。取適量的濾過液置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，破壞膠束結(jié)構(gòu)，使得PTX從膠束中游離出來溶解在甲醇溶液中，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.5.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算PTX含量，并計算該納米膠束的包封率(EE)和載藥量(DL)。

2.6 PTX/CRmP納米膠束的表征

2.6.1 PTX/CRmP納米膠束的粒徑分布與電位 稱取適量PTX/CRmP納米膠束凍干粉末，冰浴探頭超聲溶解，過0.8 μm濾膜，制備得到PTX/CRmP納米膠束溶液，用動態(tài)激光粒徑儀(DLS)測定膠束粒徑分布及Zeta電位。

2.6.2 PTX/CRmP納米膠束的形態(tài)學分析 PTX/CRmP納米膠束的形貌研究采用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)觀察。新剝離的云母片預先用雙面膠貼在金屬基片上，吸取載藥PTX/CRmP納米膠束溶液適量，滴加到云母表面上，用氮吹儀使其干燥完全。待云母片上的溶液干燥形成薄膜后，將云母片置AFM中進行觀察進行掃描觀察，顯微鏡探頭采用輕敲模式(tapping mode)探測膠束形貌。

2.7 PTX/CRmP納米膠束的體外細胞毒性

PTX/CRmP納米膠束的體外細胞毒性通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法評價。

2.7.1 細胞培養(yǎng) 將MCF-7細胞(ATCC)加入含有10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。當細胞貼壁達到約為80%～90%，細胞單層貼壁生長時即可進行傳代培養(yǎng)。

2.7.2 細胞種板 取對數(shù)生長期的細胞，按常規(guī)方法消化細胞制備單細胞混懸液，將細胞混懸液以1 200 r/min離心3 min，棄除上清液，加入新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為每毫升5×104個細胞的懸浮液，接種于96孔板中，每個孔加入細胞懸浮液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h使其貼壁。

2.7.3 細胞毒性試驗 待細胞孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液。設(shè)置不同分組，包括Taxol?組、Cremophor EL:無水乙醇混合溶劑(1∶1)組、CRmP偶聯(lián)物組、PTX/CRmP納米膠束組、空白組和對照組。將上述各組受試液向96孔板中各加入150 μL，分別含PTX濃度為1 000,500,100,50,10,5,1 nmol/L 6種不同濃度的培養(yǎng)液，每個濃度平行6個孔，以不含細胞的培養(yǎng)基和MTT溶液為空白組，含細胞不給藥物的細胞為正常組，37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別于加藥后24,48,72 h，將培養(yǎng)板取出，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后取出，小心吸取上清液。每孔加入DMSO150 μL溶解藍紫色結(jié)晶物。用酶標儀在570 nm處測定吸收度。并根據(jù)各孔的吸收度計算細胞的存活率。

3 結(jié) 果

3.1 CRmP偶聯(lián)物的合成

CMCS分子鏈上有豐富的氨基，大黃酸、mPEG-COOH結(jié)構(gòu)上含有羧基。因此，本反應(yīng)以活性較高的酰胺反應(yīng)為基礎(chǔ)，在EDC和NHS的催化下，同時活化大黃酸和mPEG-COOH的羧基，使其與CMCS的氨基發(fā)生酰胺反應(yīng)，將大黃酸、mPEG-COOH接枝到CMCS上形成CRmP偶聯(lián)物。該合成工藝(見圖1)簡單，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率較高，操作簡便易于重復。

Figure1 Synthesis of CRmP conjugate

CMCS:Carboxymethyl chitosan;CRmP：PEGylated carboxymethyl chitosan-rhein

3.2 FT-IR圖譜解析

圖2-d為mPEG-COOH的FT-IR譜圖，可以觀察到3 455 cm-1處的-OH的伸縮振動峰，2 889 cm-1處的-C-H的伸縮振動峰，1 742 cm-1處的C=O的伸縮振動峰，以及1 115 cm-1處的-C-O-C-鍵的伸縮振動峰。圖2-c為大黃酸的FT-IR譜圖。3 061 cm-1，1 693 cm-1為-COOH的振動峰。圖2-b為CMCS的FT-IR譜圖，3 423 cm-1處是-NH和-OH的伸縮振動峰，2 922 cm-1處吸收峰為-CH的伸縮振動峰，1 594 cm-1處為羧基上的-C=O伸縮振動吸收峰，1 410 cm-1處峰為-OH和-CH的環(huán)變形振動吸收峰，1 067 cm-1處峰為-C-O伸縮振動吸收峰。圖2-a為CRmP偶聯(lián)物的FT-IR譜圖，與CMCS譜圖相比，3 455 cm-1處-NH和-OH的伸縮振動吸收峰變窄，這是由于CMCS主鏈上的氨基接枝mPEG-COOH和大黃酸的影響結(jié)果，2 881 cm-1處為mPEG-COOH的重復單元(-CH2-CH2-O-)中的-C-H的伸縮振動峰，此處的伸縮振動峰變強，表明接上mPEG-COOH后引入更多的碳氫鍵，1 208 cm-1處-C-O-C-鍵的伸縮振動峰，這些是mPEG主結(jié)構(gòu)的特征吸收峰；與mPEG-COOH紅外吸收峰相比較，結(jié)合物在1 742 cm-1處羰基的伸縮振動峰消失。1 629 cm-1、1 569 cm-1處出現(xiàn)酰胺鍵Ⅰ,Ⅱ譜帶，說明mPEG-COOH、大黃酸上的羰基轉(zhuǎn)變成為酰胺鍵上的羰基。

3.3 1H NMR圖譜解析

mPEG-COOH、大黃酸、CMCS和CRmP偶聯(lián)物的1H NMR圖譜如圖3所示。圖3-c為CMCS的1H NMR 圖譜，δ4.7為溶劑(D2O)峰，δ2.00殼聚糖上脫乙酰度不完全的乙酰氨基(-NHCOH3)的質(zhì)子峰，δ3.55～3.85是殼聚糖糖環(huán)上的質(zhì)子峰(H-3，H-4，H-5，H-6)，δ3.03為CMCS糖環(huán)上C2-H質(zhì)子峰。圖3-a為mPEG-COOH核磁氫譜圖，δ4.68為溶劑(D2O)峰，δ3.34為mPEG-COOH末端甲氧基(-OCH3)質(zhì)子峰，δ3.5～3.7為mPEG-COOH重復單元(-CH2-CH2-O-)。與圖3-a、c相比較，圖3-d CRmP偶聯(lián)物1H NMR圖中δ3.47～3.87處出現(xiàn)了將強的峰，此為mPEG-COOH上的重復單元-OCH2CH2的質(zhì)子峰，此外在δ3.34出現(xiàn)了mPEG-COOH甲氧基-OCH3質(zhì)子峰，除了mPEG-COOH峰外，在δ8.12、7.84、7.75、7.73、7.41(圖3中放大部分)處出現(xiàn)了大黃酸結(jié)構(gòu)上(-CH，-OH)的質(zhì)子信號峰，此為大黃酸的特征信號峰，由此推斷CRmP偶聯(lián)物已成功合成。

Figure2 FT-IR spectra of CRmP conjugate (a),CMCS (b),rhein (c),mPEG-COOH (d)

Figure31H NMR spectra of mPEG-COOH (a),CMCS (C) in D2O,and rhein (b) in DMSO，and CRmP conjugate (d) in D2O/DMSO cosolvent (1∶1)

3.4 取代度分析

通過紫外分光光度法測得大黃酸的取代度為7.6%。從CRmP的1H NMR譜圖中可以看出，δ3.03處CMCS糖環(huán)上C2-H的質(zhì)子峰與δ3.34處mPEG-COOH末端甲氧基(-OCH3)的質(zhì)子峰易于分辨，故采用δ3.03 與δ3.34的峰面積的比值計算得到mPEG的取代度為36%。

3.5 PTX/CRmP納米膠束的形態(tài)分析

經(jīng)測定，PTX/CRmP納米膠束的平均粒徑為(204.1±10.7)nm(圖略)，PDI為(0.13±0.01)，Zeta電位為(-30.21±3.69)mV。AFM圖(圖4)中可見PTX/CRmP納米膠束形態(tài)均一，近似球形，粒徑在200 nm左右，與DLS測定的膠束粒徑結(jié)果相一致。

Figure4 AFM images of PTX/CRmP at the mode of 2D(A)and 3D(B)

PTX：Paclitaxel

3.6 PTX/CRmP納米膠束載藥量與包封率

PTX質(zhì)量濃度在1.00～90.0 μg/mL內(nèi)，其線性關(guān)系良好。線性回歸方程為A=35 855c-43 558，其相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7。分別選取3組制備得到的PTX/CRmP納米膠束，分別測定PTX的載藥量和包封率。PTX/CRmP納米膠束載藥量為(38.24±2.78)%，包封率為(79.85±7.32)%。

3.7 細胞毒性實驗

通過MTT法分別考察Taxol?的溶劑Cremophor EL-無水乙醇混合溶劑(1∶1)和載體材料CRmP偶聯(lián)物對MCF-7細胞的殺傷作用。結(jié)果(圖5)顯示，對于空白載體材料，MCF-7細胞在培養(yǎng)24、48、72 h后，載體材料CRmP偶聯(lián)物具有良好的安全性，即使孵育濃度為1 mmol/L時，對細胞的存活率也并無顯著影響，細胞存活率均在95%以上。對于PTX制劑，Taxol?及PTX/CRmP納米膠束均對MCF-7細胞有一定的抑制率。在藥物作用24、48、72 h時，Taxol?及PTX/CRmP納米膠束對MCF-7細胞的抑制作用均隨著PTX濃度的增加，表明Taxol?及PTX/CRmP納米膠束對MCF-7細胞均有時間依賴性和濃度依賴性。

PTX市售注射劑Taxol?與PTX/CRmP納米膠束均顯示出較強的細胞毒性。Taxol?與PTX/CRmP納米膠束24 和48 h孵育濃度小于5 nmol/L時，沒有顯著的細胞毒性，而PTX/CRmP納米膠束在72 h孵育濃度為5 nmol/L時表現(xiàn)出了顯著的細胞毒性，說明PTX/CRmP納米膠束在低濃度并長時間給藥后顯示出優(yōu)于Taxol?對MCF-7細胞的殺傷作用。表1中，Taxol?與PTX/CRmP納米膠束對MCF-7的IC50數(shù)據(jù)中可以看出，隨作用時間延長，PTX/CRmP納米膠束顯示出比Taxol?更好的細胞殺傷效果。

Figure5Invitrocytotoxicity of CRmP conjugate and PTX/CRmP against MCF-7 cells

Blank vehicle:Cremophor EL:ethanol (1∶1)

*P<0.05,**P<0.01

Table1 IC50values of Taxol?and PTX/CRmP against MCF-7 cells

4 討 論

在本研究中，通過PEG修飾CMCS并接枝大黃酸成功合成CRmP偶聯(lián)物，高分子CMCS和PEG具有親水性，小分子大黃酸為疏水性，因此，該偶聯(lián)物具有兩親性，能夠在水中自組裝成聚合物膠束。PTX為疏水性藥物，能夠被包載于CRmP膠束的疏水內(nèi)核中，形成載PTX的納米膠束。CRmP作為PTX的遞送載體，既增強了PTX的水溶性，同時可避免PTX直接與正常組織細胞接觸而產(chǎn)生的毒副作用。

PTX/CRmP納米膠束具有出色載藥能力，載藥量達38%；并且粒徑較小，粒徑分布均勻，能夠有效避免載藥膠束被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而清除，也能更多地通過EPR效應(yīng)遞送藥物到達腫瘤部位[19]；載藥膠束呈電負性，避免了對人體正常組織細胞的殺傷作用；PEG修飾后，可以降低膠束在體內(nèi)遞送藥物過程中與蛋白質(zhì)的結(jié)合率[20]，避免在體內(nèi)被快速清除。實驗初步結(jié)果表明PTX/CRmP納米膠束具體對PTX具有較好的負載和遞送能力，相關(guān)體內(nèi)實驗有待進一步研究。

MTT法細胞毒實驗證明了CRmP偶聯(lián)物具有極低的細胞毒性，因此，其可以作為安全的載體材料應(yīng)用于水難溶性藥物的遞送。PTX/CRmP納米膠束在MCF-7細胞系體現(xiàn)出的時間依賴性的體外細胞毒性，表明PTX/CRmP納米膠束由于載體材料的包載，在短時間內(nèi)細胞毒性作用并未體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，但能夠隨時間推移而呈現(xiàn)較強的腫瘤細胞殺傷作用，其對腫瘤細胞的殺傷機制是否與載體材料上的小分子大黃酸的抗腫瘤作用相關(guān)，有待深入研究。

綜合以上實驗結(jié)果，本研究所合成的CRmP偶聯(lián)物具有較好的納米載體特征，所制備的PTX/CRmP納米膠束預期能夠?qū)TX起到很好的體內(nèi)遞送作用，其將在通過EPR效應(yīng)的被動靶向腫瘤給藥方向具有良好的應(yīng)用前景。