楊 薇，王紹達，秦淑杰，吳 綱，何書英

(中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種嚴重危害人類健康的心血管常見疾病，可誘發(fā)腦血管病、冠心病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病[1]。目前認為，動脈粥樣硬化的發(fā)生是由于細胞因子和血管細胞間的相互作用，在各種危險因子的作用下，血管內皮細胞損傷致使多種生長調節(jié)因子、細胞因子和血管活性物質的表達、激活紊亂[2]，并改變平滑肌細胞基因的表達致使其異常增殖，從而引起血管腔狹窄和痙攣，使血管局部產生的一種過度的慢性炎性增生反應。在這個過程中，大量的炎性細胞因子參與其中，對AS的發(fā)生和發(fā)展起到了至關重要的作用[3]，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血清樣淀粉蛋白P(serum amyloid P，SAP)、單核細胞趨化蛋白1(momocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)等。

MAPK和NF-κB信號通路是介導炎癥反應相關通路中最常見的兩條通路，其關鍵蛋白被磷酸化激活后可導致通路中的相應蛋白發(fā)生核轉位，從而調控下游基因的轉錄活性。在AS病變的早期，NF-κB激活內皮細胞分泌MCP-1和IL-8，介導單核細胞和淋巴細胞向管壁運動，促進炎癥的發(fā)生和內皮細胞的損傷[4]。由此可見，抑制促炎性細胞因子的合成及其相關信號通路關鍵蛋白的表達是控制AS的有效手段之一。

鹽酸芐絲肼(benserazide hydrochloride)是外周脫羧酶抑制藥，與左旋多巴聯(lián)合應用制成復方制劑多巴絲肼[5]，在臨床上常用于帕金森病的治療。本實驗室前期動物實驗研究表明，鹽酸芐絲肼可顯著降低ApoE-/-小鼠主動脈根、主動脈弓的動脈斑塊面積，并可顯著下調與AS相關的炎癥因子的表達(結果待發(fā)表)。故本研究通過脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導人臍靜脈內皮細胞建立體外炎癥模型，以進一步評估鹽酸芐絲肼的體外抗炎活性，并探究鹽酸芐絲肼抗動脈粥樣硬化的相關機制。

1 材 料

1.1 試 劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；鹽酸芐絲肼(美國Alfa Aesar公司，CAS:14919-77-8，AR：98%，批號:C10006404)、LPS(美國Sigma公司)；四甲基偶氮唑鹽(合肥Biosharp公司)；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ECL檢測液試劑盒(博士德生物工程有限公司)；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；人MCP-1 ELISA檢測試劑盒(武漢六合生物技術有限公司)；人TNF-α ELISA檢測試劑盒(深圳達科為生物技術有限公司)；Trizol溶液(美國Invitrogen公司)；反轉錄合成一體試劑盒(5×ALL-In-One RT MasterMix)、快速EvaGreen熒光定量PCR預混試劑盒(EvaGreen 2×qPCR MasterMix)、96孔qPCR板(加拿大ABM公司)；PCR引物(通用生物系統(tǒng)有限公司)；GAPDH抗體(美國Abways公司)；HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)(麥約爾生物技術有限公司)?？筍AP抗體、抗IκBα抗體、抗p-IκBα(phospho S36)抗體、抗p38抗體(英國Abcam公司)；p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗體(美國Affinity Biosciences公司)；兔抗NFκB p65抗體、兔抗p-NFκB p65(Thr254)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；抗AKT抗體、抗p-AKT(Ser473)抗體(美國CST公司)；Lamin b1抗體(美國Signalway抗體公司)。

1.2 儀 器

TGL-20M高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)；Synergy 2型微孔板分析儀(美國Bio-Tek公司)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)、MyCyclerTMThermal Cycler System(美國Bio-Rad公司)；480Ⅱ型Real-Time qPCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3 細胞株

人臍靜脈內皮細胞株(HUVECs)由中國藥科大學生命科學與技術學院徐寒梅教授實驗室提供。

2 方 法

2.1 藥物配制

鹽酸芐絲肼性質極不穩(wěn)定，對光照、溫度、溶劑的pH變化很敏感，故本實驗采用生理鹽水作為溶劑，配制初始濃度為1×10-7moL/L的鹽酸芐絲肼溶液，在配藥過程中避光處理，并采用0.22 μm微孔濾器對藥物進行過濾，于超凈臺中配制完成后在容器表面包裹錫箔紙并置于4 ℃避光保存。

2.2 細胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入0.5%青霉素鏈霉素雙抗溶液，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱，傳代周期為2～3 d[6]。

2.3 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)急性炎癥模型的建立

將HUVECs以每孔2×105個細胞的密度接種于無菌6孔板中，待細胞生長至80%細胞密度時，將細胞分為空白組(PBS+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基)和模型組、模型組[LPS(300、500、700、900 μg/mL)+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基]，每組設置3個復孔，培養(yǎng)24 h。取上清液，離心，并將離心后的細胞上清液轉移到新的EP管中，于-20 ℃冰箱保存，并用試劑盒檢測不同實驗組中TNF-α水平的變化情況。

2.4 MTT測定鹽酸芐絲肼的細胞毒性

將HUVECs按每孔1×103個細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，將細胞分為空白組(0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基)、給藥組(0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基+1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12mol/L鹽酸芐絲肼)，每組設置6個復孔。孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h后，棄去細胞培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，溶解結晶，于水平搖床振蕩混勻10 min后于490 nm處測定各孔吸收度。

2.5 Western blot和ELISA測定HUVECs細胞中相關炎癥因子的表達水平

將HUVECs以每孔2×105個細胞的密度接種于無菌6孔板中，待細胞生長至80%細胞密度時，將細胞分為空白組(PBS+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基)、模型組[LPS(500 μg/mL)+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基]，給藥組[LPS(500 μg/mL)+鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基]，每組設置3個復孔，培養(yǎng)24 h。取上清液，離心，并將離心后的細胞上清液轉移到新的EP管中，于-20 ℃冰箱保存，并用試劑盒檢測不同實驗組中TNF-α和MCP-1水平的變化情況。余下的各組細胞用胰酶消化后，4 ℃離心收集細胞沉淀，用RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白，并用Western blot測定不同實驗組中SAP蛋白的表達水平。

2.6 qPCR測定HUVECs細胞中相關炎癥因子mRNA的表達水平

將HUVECs以每孔2×105個細胞的密度接種于無菌6孔板中，細胞培養(yǎng)和分組同“2.5”項，每組設置3個復孔。培養(yǎng)24 h后，取出孔板，棄去上清液，用冷0.01 mol/L PBS洗滌2遍，每管加入Trizol 1 mL，混勻，靜置10 min后，加入氯仿200 μL，劇烈混勻15 s，室溫靜置5 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上層水相(約500 μL)置于另一EP管中，加異丙醇500 μL，混勻，-20 ℃放置30 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。棄去上清液，加入預冷75%乙醇(DEPC水配制)1 mL，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，置于超凈臺室溫干燥3 min，待乙醇揮發(fā)后加入DEPC水20 μL溶解RNA，用Synergy 2型微孔板分析儀測定RNA濃度，按照反轉錄合成一體試劑盒說明書將各組分RNA反轉錄成cDNA，保存于-20 ℃?？焖貳vaGreen熒光定量PCR預混試劑盒說明書，在96孔qPCR板中依次加入各試劑，每組設置4個復孔，使用Real-Time qPCR儀檢測，反應條件設置為：95 ℃、10 min(預變性)；95 ℃、15 s(變性)；60 ℃、60 s(退火/延伸)；擴增40個循環(huán)。得出各組分的Ct，采用2-ΔΔCt法計算。

2.7 Western blot測定HUVECs細胞信號通路中關鍵蛋白的表達水平

將HUVECs以每孔2×105個細胞的密度接種于無菌6孔板中，細胞培養(yǎng)和分組同上，每組設置3個復孔。培養(yǎng)24 h后，取出孔板，棄去上清液，用冷0.01 mol/L PBS洗滌2遍，胰酶消化后4 ℃離心收集細胞沉淀，再用冷0.01 mol/L PBS洗滌沉淀2遍，每管加入RIPA裂解液(含廣譜蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)150 μL于冰上裂解細胞30 min，4 ℃離心，將上清液轉移到新的EP管中，即為細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并定量，經10%或12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉法將蛋白電轉移到PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉膜2 h，與GAPDH、IκBα、p-IκBα(phospho S36)、p38、p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)、NFκB p65、p-NFκB p65(Thr254)、AKT、p-AKT抗體濕盒內4 ℃孵育過夜。第2天，室溫下TBST洗滌(10 min×4)，室溫山羊抗兔二抗避光孵育1.5 h，TBST洗滌(10 min×3)，ECL化學發(fā)光法顯影，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照，并用Image-J進行條帶灰度分析。

2.8 核蛋白和胞漿蛋白提取

細胞處理及分組同上，培養(yǎng)24 h后，取出孔板，棄去上清液，用冷0.01 mol/L PBS洗滌2遍，胰酶消化后4 ℃，1 500 r/min離心3 min收集細胞沉淀，再用冷0.01 mol/L PBS洗滌沉淀2遍；用移液槍盡可能棄去上清液，勿留殘液，估計細胞壓積(離心后的緊實細胞體積，約50～100 μL)，使用試劑盒提取核蛋白以及胞漿蛋白，BCA蛋白定量后分裝并保存于-80 ℃，避免反復凍融。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結 果

3.1 LPS誘導HUVECs炎癥模型的建立

為了確定構建HUVECs炎癥模型所需的LPS劑量，將細胞分為空白組和模型組(分別加入300、500、700、900 μg/mL LPS)，共同孵育24 h后吸取細胞上清液，通過ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α水平的變化。如圖1所示，與空白組相比，當LPS質量濃度在300～500 μg/mL之間時，TNF-α的表達量隨著LPS質量濃度的升高而升高，當LPS質量濃度在500～900 μg/mL之間時，TNF-α的表達量隨著LPS濃度的升高反而出現(xiàn)下降的趨勢。綜合數(shù)據分析結果，與空白組相比，所有加入LPS的模型組均能刺激細胞分泌更多的TNF-α，當LPS質量濃度為500 μg/mL時，細胞分泌的TNF-α最多，且與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，因此，最終選用500 μg/mL的LPS為本實驗后續(xù)造模濃度。

3.2 不同濃度鹽酸芐絲肼對HUVECs的細胞毒性

不同濃度鹽酸芐絲肼(1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12mol/L)作用HUVECs 24 h后，結果如圖2所示，鹽酸芐絲肼濃度為1×10-7mol/L組與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，而1×10-12mol/L組有極顯著性差異(P<0.01)，除此之外，其余濃度對HUVECs 的生長均沒有顯著影響，因此結合數(shù)據分析結果所呈現(xiàn)的不同濃度鹽酸芐絲肼對HUVECs生長影響的穩(wěn)定性，選用1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L 3個濃度作為后續(xù)實驗的鹽酸芐絲肼給藥濃度。

*P<0.05vsmodel group (LPS-treated group)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3.3 鹽酸芐絲肼對LPS誘導的HUVECs細胞中SAP、TNF-α和MCP-1的蛋白和mRNA表達的影響

在LPS(500 μg/mL)/LPS+鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用HUVECs 24 h后，取細胞上清液，用ELISA檢測TNF-α和MCP-1的表達水平，余下的細胞提取總蛋白后用Western blot檢測SAP的表達水平，同時，用Trizol試劑提取細胞RNA，通過qPCR檢測細胞SAP、TNF-α和MCP-1 mRNA的表達水平。如圖3-A所示，與空白組相比，模型組的SAP、TNF-α、MCP-1的表達水平顯著升高(P<0.01)；而與模型組相比，給藥組使SAP、TNF-α、MCP-1的表達水平均出現(xiàn)下降的趨勢。當鹽酸芐絲肼濃度為1×10-9mol/L時，與模型組相比，SAP、TNF-α減少的量最多且有極顯著性差異(P<0.01)，MCP-1則無明顯差異；當鹽酸芐絲肼濃度為1×10-10mol/L時，與模型組相比，SAP(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)和MCP-1(P<0.05)均具有顯著性差異；當鹽酸芐絲肼濃度為1×10-11mol/L時，與模型組相比，僅有MCP-1出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，而SAP和TNF-α則無明顯差異。與此同時，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對于SAP和TNF-α表達的抑制作用具有相似的濃度依賴性。如圖3-B所示，模型組的SAP(P<0.001)、TNF-α(P<0.05)和MCP-1(P<0.001)mRNA的表達量相較于空白組均出現(xiàn)了明顯的升高趨勢，且具有顯著性差異；加入鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用后均使SAP、TNF-α和MCP-1 mRNA的表達量明顯下降，且與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.001)。除TNF-α外，給藥組SAP和MCP-1 mRNA的下降趨勢與其蛋白下降趨勢相似。圖3的結果表明，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能下調 SAP、TNF-α和MCP-1蛋白及mRNA的表達。

A:Protein level of SAP,TNF-α and MCP-1 in different groups measured by Western blot and ELISA;B:mRNA level of SAP,TNF-α and MCP-1 in different groups measured by qPCR

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group(LPS-treated group)

3.4 鹽酸芐絲肼對LPS誘導的HUVECs細胞信號通路中關鍵蛋白表達的影響

如圖4所示，在LPS的刺激下，除了IκBα(如圖4-C)，p65、p38、AKT及其磷酸化蛋白p-p65、p-p38、p-AKT和p-IκBα的表達量有了明顯的上升趨勢，且均具有顯著性差異(P<0.01/P<0.001/P<0.05)。在不同濃度的鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用下，p65/p-p65、IκBα/p-IκBα、AKT/p-AKT和p-p38表達水平都受到了不同程度的抑制，且均具有顯著性差異(P<0.01/P<0.001/P<0.05)。當鹽酸芐絲肼濃度為1×10-11mol/L時，相較于模型組，雖然對p38的表達有抑制作用而無顯著性差異，但鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)的這種抑制作用表現(xiàn)出了濃度依賴性(如圖4-B)。除此之外，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對p-p65和AKT的表達也表現(xiàn)出了濃度依賴性的抑制作用(如圖4-A、D)。信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平在一定程度上可以反映出該條通路的激活程度以及信號轉導的情況，圖4所有數(shù)據表明，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)在抑制非磷酸化蛋白p65、p38、IκBα和AKT的表達的同時也能顯著抑制其對應的磷酸化蛋白p-p65、p-p38、p-IκBα和p-AKT的表達，說明鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能抑制AKT/NF-κB通路及p38 MAPK部分通路的激活。

A:Protein level of p65 and p-p65;B:Protein level of p38 and p-p38；C:Protein level of IκBα and p-IκBα；D:Protein level of AKT and p-AKT

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group(LPS-treated group)

3.5 鹽酸芐絲肼對LPS誘導的HUVECs細胞信號通路中p65、p38和IκBα核轉位的影響

在LPS(500 μg/mL)/LPS+鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用HUVECs 24 h后，用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒分別提取不同實驗組的核蛋白及其對應的胞漿蛋白，BCA定量后用Western blot檢測細胞核內和胞漿內p65、p38以及IκBα的分布情況。如圖5所示，正常情況下，p65、p38及IκBα主要存在于細胞質中；在LPS的刺激下，細胞迅速做出應答，這些因子被迅速激活并轉位入核，從而激活與該信號通路相關的基因的大量表達，但加入鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)后，p65、p38及IκBα入核顯著減少，且與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.01/P<0.001，圖5-A)，由此說明，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能明顯抑制 p65、p38及IκBα的核轉位。

A:Distribution of p65，p38 and IκBα in nucleus；B:Distribution of p65，p38 and IκBα in cytoplasm

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group (LPS-treated group)

4 討 論

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要組成成分之一，當它進入機體時，會誘導免疫細胞的激活，導致促炎性細胞因子的釋放，是誘發(fā)炎癥反應的最主要的病原分子之一[7]。本實驗室前期動物實驗研究已經表明，鹽酸芐絲肼可顯著降低ApoE-/-小鼠主動脈根、主動脈弓的動脈斑塊面積，肝臟SAP的表達及其在動脈內膜上的沉積，并可顯著下調相關炎癥因子的表達，初步顯示出鹽酸芐絲肼具有良好的抗動脈粥樣硬化的潛力(結果待發(fā)表)。在此基礎上，本研究采用LPS刺激人臍靜脈內皮細胞建立體外炎癥模型，以進一步評估鹽酸芐絲肼的體外抗炎活性，并探索其發(fā)揮作用的潛在機制。

炎癥貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的整個過程，在這個過程中，血管內皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞都會持續(xù)分泌大量的促炎性細胞因子，加重受損部位的炎癥反應從而加速AS的發(fā)展進程，因此檢測藥物作用后炎癥因子的表達水平變化對評估其抗炎活性有一定意義。綜合Western blot、ELISA以及qPCR的檢測結果，可以看出，正常的HUVECs細胞只分泌少量的炎癥因子，但在LPS的刺激下SAP、TNF-α和MCP-1的表達量迅速上升，而不同濃度鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對SAP、TNF-α和MCP-1的蛋白及mRNA的表達水平均具有顯著抑制作用，說明鹽酸芐絲肼具有良好的體外抗炎活性。

MAPK和NF-κB信號通路是炎癥及炎癥相關疾病(如動脈粥樣硬化)中發(fā)揮主要作用的兩條信號通路，已得到廣泛研究。EI Bekay等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK被激活后，可通過磷酸化或促炎細胞因子(如TNF-α、ICAM-1)而活化NF-κB。同樣NF-κB被激活后，也可能通過其促炎細胞因子產物反過來激活p38 MAPK，NF-κB與p38 MAPK之間形成的相互激活網絡可以調控多種炎癥介質的基因轉錄活性，促進AS的發(fā)展進程[9]。因此，本實驗在探索鹽酸芐絲肼抗炎抗動脈粥樣硬化的分子機制時，首先針對p38 MAPK和NF-κB這兩條信號通路進行研究。綜合Western blot測定的鹽酸芐絲肼對LPS誘導的HUVECs細胞信號通路中關鍵蛋白表達的影響的所有結果，可以看出，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對p65、p38、IκBα和AKT的非磷酸化蛋白水平及其對應的磷酸化蛋白水平(即p-p65、p-p38、p-IκBα和p-AKT)均具有明顯的抑制作用，說明鹽酸芐絲肼能抑制AKT/NF-κB通路及p38 MAPK部分通路的激活。

信號通路被逐級激活后，通常會促使該通路中的蛋白發(fā)生核轉位，從而調控該通路下游蛋白的基因的轉錄活性。Western blot檢測到的細胞核內以及胞漿內p65、p38和IκBα的分布情況顯示，細胞在正常狀態(tài)下核內僅分布極少量的p65、p38和IκBα，但在LPS的刺激下，這些因子被迅速激活并轉位進入細胞核中，而鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能顯著抑制p65、p38、IκBα的核轉位。

綜上所述，鹽酸芐絲肼可能通過抑制AKT/NF-κB通路及p38 MAPK部分通路的激活和核轉位來抑制由其介導的LPS所致HUVECs細胞中相關促炎性細胞因子的表達，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用。