張紅燕，朱文旭，趙 誠，張宏葉，王 濤，陳樹橋，尹紹武，賈永義

（1．南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海洋科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023；2．浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江湖州 313001；3．南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036）

魚類的性別決定機制具有多樣性、易變性和原始性等特點［1］，可分為單性（unisexuality）、雌雄同體（hermaphroditism）和雌雄異體（gonochorism）［2］。絕大多數(shù)魚類為雌雄異體，少數(shù)魚類雌雄同體［3］。硬骨魚的性別決定一般取決于遺傳和環(huán)境兩大因素，而且這種作用具有可塑性［3］。多種環(huán)境因素如外源激素、溫度、pH、水質(zhì)以及鹽度等都可能影響性別決定，但是決定性別的基礎(chǔ)是遺傳基因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展［4］，魚類性別決定相關(guān)基因如 DMY基因［5］、芳香化酶基因［6］、Sox基因家族［7］和 DMRT基因家族［15－20］等都被廣泛研究報道。

DMRT（double-sex and mab-3 related transcription factor）基因家族的成員與性別決定和分化相關(guān)，其中DMRT1基因在演化過程中具有高度的保守性［8］。DMRT1基因位于級聯(lián)反應(yīng)的上游，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對雄性性腺的形成和功能的維持、多種組織和器官的分化和形成具有重要意義［9］。在無脊椎動物果蠅（Drosophila melanogaster）和線蟲（Caenorhabditis elegans）的性別決定基因中發(fā)現(xiàn)了共有的DM結(jié)構(gòu)域［10］；在脊椎動物的兩棲類如黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）中DMRT1基因在雄性性腺中特異性表達(dá)［11］；鳥類DMRT1蛋白的表達(dá)量減少會導(dǎo)致胚胎中雄性（ZZ）性腺的雌性化［12］；小鼠（Musmusculus）的DMRT1基因調(diào)控精原細(xì)胞的發(fā)育及分化［13］；人類若發(fā)生DMRT1基因的片段缺失會阻礙精巢的發(fā)育［14］。DMRT1基因在魚類中廣泛存在，目前在斑馬魚（Danio rerio）［15］、青鳉（Oryzias latipes）［16］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［7］、奧 里 亞 羅 非 魚 （Oreochromisco aureus）［2］、非洲胡子鯰（Clarias gariepinus）［17］、烏鱧（Channa argu）［18］、西 伯 利 亞 鱘 （Acipenser baerii）［19］等魚類中已進(jìn)行過廣泛的報道研究，DMRT1可作為斑馬魚幼苗時期性別決定的指示基因［15］，能夠調(diào)節(jié)青鳉精原細(xì)胞的分化［16］。此外，該基因被認(rèn)為是尼羅羅非魚精巢分化的分子標(biāo)記［7］，由此可見，DMRT1基因參與了脊椎和無脊椎動物的性別決定和分化過程［20］。

河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila），又名虎頭鯊、塘蒲、土布魚、虎頭呆子等，分布于長江、閩江、錢塘江等水域，是一種小型淡水底棲的肉食性魚類。其肉質(zhì)鮮美、細(xì)嫩可口，深受人們歡迎，具有廣闊的市場開發(fā)前景［21］。目前在江浙滬等地區(qū)，雖然廣泛開展河川沙塘鱧的混養(yǎng)和套養(yǎng)［22］，但產(chǎn)量仍不能滿足日益增大的消費需求。河川沙塘鱧在生長速度方面顯示出明顯的性別二態(tài)性，表現(xiàn)為雄性河川沙塘鱧比同期雌性生長速度快30%以上［23］，因此養(yǎng)殖雄性個體比雌性個體有著更大的經(jīng)濟(jì)效益。然而，目前關(guān)于河川沙塘鱧性別決定機制方面的研究非常有限，這很大程度上阻礙了河川沙塘鱧的遺傳育種研究。DMRT1基因作為一個保守的性別決定基因，其研究對于開展河川沙塘鱧單性育種技術(shù)具有重要意義。因此，本文首次克隆河川沙塘鱧的DMRT1的全長基因，并采用qRT-PCR技術(shù)研究DMRT1基因在其不同組織、不同發(fā)育階段的性腺以及不同時期的胚胎中的表達(dá)情況，旨在為河川沙塘鱧性別決定分子機制的解析提供基礎(chǔ)資料，也為今后河川沙塘鱧開展全雄育種打下堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

河川沙塘鱧取自江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所周崗基地。暫養(yǎng)于循環(huán)缸內(nèi)7 d，確定無病后開始取樣。在胚胎發(fā)育期間，在8個不同的發(fā)育階段（受精卵期、桑椹胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、體節(jié)期、口裂期、出膜后1 d、出膜后3 d）取樣，每個胚胎時期各取30粒卵，孵化后1 d、3 d各取10尾仔魚；此外，隨機取3尾成魚［雌雄均為1齡生，體質(zhì)量為（30．0±1．5）g］的 8種組織：鰓、腸、心、肌肉、腦、肝、脾、性腺以及4個不同發(fā)育時期的性腺（河川沙塘鱧的性腺分期的標(biāo)準(zhǔn)均參考中華烏塘鱧 Bostrichthys sinensis）［24］，取樣后迅速置于液氮中冷凍10 min，然后存放于－80℃冰箱中備用。PCR引物購自上海生物工程有限公司；高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）購自諾唯贊公司，美國；SMARTerTMRACE cDNA AmplificationKit購自Clontech公司，美國；熒光定量試劑盒Faststart Universal SYBR Green Master購自羅氏公司，瑞士；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript TM QRT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）購自諾唯贊公司，美國。

1．2 DMRT1基因總RNA的提取

將凍存于－80℃的組織根據(jù)高純度總RNA快速抽提試劑盒的說明按步驟抽提總RNA。每個樣品的RNA濃度及純度用RNA濃度測定儀（Thermo，NANO DROP 2000C，北京）測定（OD260／OD280＝1．95～2．05），用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1．3 DMRT1基因cDNA的全長擴增

以河川沙塘鱧總 RNA為模板，按照HiScriptTM1 ST Strand cDNA Synthesis Kit的說明進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈。根據(jù)在河川沙塘鱧轉(zhuǎn)錄組測序所得的cDNA文庫進(jìn)行篩選，得到DMRT1基因的cDNA中間EST序列，長度約為894 bp，根據(jù)其設(shè)計 5′RACE和 3′RACE序列擴增引物，分別按照的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2．0試劑盒和Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒的方法進(jìn)行操作。擴增基因所需的引物見表1。

表1 DMRT1基因擴增所用引物Tab．1 Primers used for DMRT1 genes amplification

1．4 DMRT1基因的生物信息學(xué)分析

將DMRT1保守區(qū)片段、3′端序列及5′端序列進(jìn)行拼接，得到DMRT1序列的總長，其結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用BLAST程序（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）進(jìn)行檢索，得到與河川沙塘鱧開放閱讀框（ORF）高度同源的核苷酸和氨基酸序列。使用軟件DNAman進(jìn)行多序列比對；開放閱讀框氨基酸序列及氨基酸序列的理論分子量（MW）、等電點（pI）等用蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy，http：／／www．expasy．org／tools／protparam．html）進(jìn)行預(yù)測。使用 SMART（http：／／smart．embl-heidelberg．de／）軟件對預(yù)測到的序列進(jìn)行分析，包括所組成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特點、結(jié)構(gòu)域等。使用 SignalP 4．1（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號肽的預(yù)測。使用同源建模網(wǎng)站 Swiss-model（http：／／swissmodel．expasy．org／）預(yù)測蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。根據(jù)GenBank中已有物種的DMRT1氨基酸序列，用MEGA 5．0軟件構(gòu)建 N-J系統(tǒng)發(fā)育樹［25］。

1．5 河川沙塘鱧DMRT1基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)分析

對河川沙塘鱧不同組織、胚胎不同時期和性腺不同發(fā)育階段的材料，分別提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)目前已獲得的cDNA的全長序列分別設(shè)計特異性引物DMRT1-F、DMRT1-R，以及作為內(nèi)參基因的β-actin基因特異性上下游引物 β-actin-F、β-actin-R（表 1），已有研究證明β-actin基因可作為河川沙塘鱧性腺的內(nèi)參基因［26］。分別以8種組織和8個胚胎發(fā)育時期和4個雌雄性腺發(fā)育時期的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴增，來檢測DMRT1基因的mRNA在河川沙塘鱧不同組織及胚胎不同時期和性腺不同發(fā)育時期的表達(dá)情況。

熒光定量 PCR反應(yīng)體系 20μL：Faststart Universal SYBR Green Master 10μL，正反向引物各3μL，cDNA模板4μL。擴增程序為：95℃10 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，共40個循環(huán)，于4℃冰箱中進(jìn)行保存［27］。所有樣品檢測實驗重復(fù)3次。其中，每條引物配置成的工作液濃度為2 μmol·μL－1，cDNA模板的濃度為5 ng·μL－1。

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示。目的基因的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCt法進(jìn)行計算，實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析、差異顯著性檢驗分析用SPSS 19軟件進(jìn)行處理，用One-Way ANOVA計算P值，當(dāng) P＜0．05時為差異顯著。使用Origin 8．6軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 DMRT1基因的全長序列分析

通過 RACE技術(shù)克隆得到：河川沙塘鱧DMRT1基因cDNA的全長序列為2 025 bp，包括編碼297個氨基酸的開放閱讀框（ORF）894 bp、73 bp的5′非編碼區(qū)和1 058 bp的3′非編碼區(qū)。其中，3′非編碼區(qū)具有脊椎動物典型的加尾信號AATAAA和25 bp的PolyA尾巴，表明獲得的該cDNA全長序列的完整性（圖1）。

圖1 河川沙塘鱧DMRT1 cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig．1 Nucleotide and translated am ino acid sequences of DMRT1 cDNA in O．potamophila

通過ExPASy軟件預(yù)測所得的氨基酸分子量為170 519．30，理論等電點為4．91。DMRT1基因的編碼區(qū)經(jīng)SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)，其不存在信號肽序列，不屬于分泌蛋白。通過SMART軟件對DMRT1基因的ORF區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，共包含有2個結(jié)構(gòu)域，分別是DM結(jié)構(gòu)域（18 aa）、Pfam蛋白結(jié)構(gòu)（23 aa）。

2．2 河川沙塘鱧DMRT1基因氨基酸序列的同源性分析

將河川沙塘鱧DMRT1基因輸入GenBank進(jìn)行注冊（登錄號：MG585938）。使用 DNAman軟件將河川沙塘鱧與其它7種已知物種的DMRT1基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列對比，以檢測同源性。結(jié)果顯示，河川沙塘鱧的DMRT1基因的氨基酸序列與另外7種已知物種氨基酸序列同源性在11．6～80%之間，其中與硬骨魚類的相似度均大于50%，與其它類別的脊椎動物的相似度則小于 50%。其中，與同為鱸形目軍曹魚（Rachycentron canadum）和歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）的同源性最高，分別為80%和77%，與鳉形目花斑劍尾魚（Xiphophorus maculatus）、鲀形目的紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）以及鯉形目的斑馬魚的同源性次之，分別為 74%、64．33%、53．49%，與哺乳綱的家鼠（Musmusculus）以及鳥綱的原雞（Gallusgallus）的同源性最低，分別為32．62%和16．11%（圖2）。

圖2 河川沙塘鱧與其它物種DMRT1氨基酸序列對比Fig．2 Comparison of translated am ino acid sequences of DMRT1 gene in O．potamophila w ith other species

為研究河川沙塘鱧DMRT1基因與其它物種之間的同源性，采用MEGA 5．0以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果表明，在進(jìn)化樹的兩大分支中，所有的魚類聚為一支，而與魚類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的爬行類、鳥類和哺乳類的動物聚為另外一支，這與傳統(tǒng)的分類情況是一致的，基本符合從低等無脊椎動物向高等脊椎動物乃至人類的進(jìn)化過程，物種之間進(jìn)化地位的差異推測與DMRT1基因DM保守區(qū)域氨基酸序列的變異情況有關(guān)。此外，由進(jìn)化樹可以得知，河川沙塘鱧與同為鱸形目的軍曹魚以及金錢魚（Scatophagus argus）同源性較高，表明其親緣關(guān)系較近。

2．3 河川沙塘鱧DMRT1基因空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測

應(yīng)用同源建模網(wǎng)站 Swiss-model，以人類DMRT1基因的三維結(jié)構(gòu)為模板（4yj0．1），推測出河川沙塘鱧DMRT1基因的三維結(jié)構(gòu)（圖4），該三維結(jié)構(gòu)與人類性別決定基因的DM結(jié)構(gòu)域有相同構(gòu)型，序列相似度達(dá) 60%，序列同源性達(dá)90．32%，都具有與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。

2．4 河川沙塘鱧DMRT1基因組織差異性表達(dá)情況分析

通過qRT-PCR技術(shù)對河川沙塘鱧雌雄個體的各個組織的表達(dá)情況檢測分析，由圖5可知，河川沙塘鱧DMRT1基因在精巢中大量表達(dá)，在卵巢、肌肉、心臟、肝4種組織中表達(dá)較少，而在鰓、腸、腦、脾4種組織中幾乎不表達(dá)。

圖4 河川沙塘鱧DMRT1基因的三維結(jié)構(gòu)Fig．4 Three-dimension structure of O．potamophila DMRT1

圖5 DMRT1在河川沙塘鱧不同組織中的表達(dá)Fig．5 DMRT1 gene expressions in various tissues of O．potamophila

2．5 河川沙塘鱧DMRT1在胚胎和仔魚不同發(fā)育時期表達(dá)差異

通過qRT-PCR技術(shù)對河川沙塘鱧的胚胎和仔魚在不同發(fā)育時期表達(dá)情況進(jìn)行分析。由圖6可知，在胚胎各個時期到仔魚發(fā)育初期，都可以檢測到DMRT1基因的表達(dá)，具有廣泛表達(dá)的特點，其表達(dá)量隨著河川沙塘鱧的不斷發(fā)育呈先上升后下降的趨勢，在原腸胚時期達(dá)到最高值，顯著地高于其它發(fā)育階段（P＜0．05），之后才逐漸降低。

圖6 DMRT1在河川沙塘鱧胚胎期和仔魚發(fā)育早期表達(dá)Fig．6 DMRT1 gene expressions during the embryonic and early larval development of O．potamophila

2．6 河川沙塘鱧DMRT1在性腺不同時期表達(dá)差異

通過qRT-PCR技術(shù)對河川沙塘鱧DMRT1基因在性腺不同時期的表達(dá)情況進(jìn)行分析。由圖7可知，在河川沙塘鱧精巢發(fā)育的各個時期都有所表達(dá)，但不同時期表達(dá)強度存在差異，其在精巢發(fā)育的各個時期呈先下降后上升的趨勢，在精子成熟期（IV期）達(dá)到最大值，而DMRT1基因在卵巢發(fā)育的各個時期表達(dá)量較少且表達(dá)強度差異不明顯。

3 討論

3．1 河川沙塘鱧DMRT1的全長基因和保守性分析

DMRT1基因是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個同時存在于無脊椎動物和脊椎動物中的性別相關(guān)基因［28］，廣泛參與物種的性別決定、分化過程以及器官的功能維持［29］。然而，物種間進(jìn)化地位和性別決定機制的差異使其在性別發(fā)育過程中作用及表達(dá)特性也存在較大的差異［2］。

圖7 DMRT1在河川沙塘鱧性腺不同時期的表達(dá)Fig．7 DMRT1 gene expressions in different gonadal development stages of O．potamophila

本研究對其表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測表明河川沙塘鱧DMRT1基因共包含有2個結(jié)構(gòu)域，分別是DM結(jié)構(gòu)域和Pfam蛋白結(jié)構(gòu)，其中DM結(jié)構(gòu)域是一段包含用以鋅離子螯合的鋅指結(jié)構(gòu)（C2H2C4）的保守區(qū)，而此保守區(qū)的鋅指蛋白可結(jié)合受控基因的啟動子以調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)［28］，最終影響精巢的發(fā)育。

通過河川沙塘鱧DMRT1基因cDNA全長序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因在分子進(jìn)化過程中具有高度的保守性，尤其是DM結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過表達(dá)氨基酸序列同源性比對，河川沙塘鱧與同為鱸形目的軍曹魚和歐洲鱸魚的同源性最高，與其它目硬骨魚氨基酸序列相比也表現(xiàn)出了高度的同源性，雖然與哺乳類、鳥類氨基酸序列的同源性較低，但序列比對結(jié)果表明，其結(jié)構(gòu)域特定部位的氨基酸序列是高度保守的，推測這些序列的組成對于維持DMRT1基因的結(jié)構(gòu)和功能可能是必需的。利用DMRT1基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建了進(jìn)化系統(tǒng)樹，在進(jìn)化樹的兩大分支中，河川沙塘鱧與所有的硬骨魚類聚為一簇，如鱸形目的軍曹魚、金錢魚等，而爬行類、鳥類和哺乳類的動物聚為另外一支，聚類分析各參考物種與其組成的進(jìn)化樹的分類地位基本吻合［28］，由此可以推測河川沙塘鱧在系統(tǒng)進(jìn)化過程中的分類地位，這也表明DMRT1基因在不同進(jìn)化地位的物種間具有一定差異，這種差異與親緣關(guān)系的聯(lián)系十分密切。此外，空間結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，河川沙塘鱧DMRT1基因的三維結(jié)構(gòu)與人類性別決定基因的DM結(jié)構(gòu)域有著相同構(gòu)型，序列相似度達(dá)60%，同源性更是高達(dá)90．32%。由此可見，DMRT1在物種進(jìn)化過程中具有高度的保守性。

3．2 河川沙塘鱧DMRT1基因組織差異性分析

DMRT1基因在一些魚類中早已被成功克隆且對其在性腺組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。KOBAYASHI等［16］對青鳉研究發(fā)現(xiàn)，DMRT1在其發(fā)育不同階段的多種組織中均有表達(dá)。而在斑馬魚［30］、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）［31］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［32］、 黑 鯛 （Sparus macrocephlus）［33］、非 洲 胡 子 鲇［17］、紅 鰭 東 方鲀［34］、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）［35］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）［36］和尼羅羅非魚［7］等魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，DMRT1基因的表達(dá)具有性別二態(tài)性，即在雄性成體精巢中具有特異性的表達(dá)或在精巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢中表達(dá)量［37］。DMRT1基因在兩性中差異性表達(dá)的特點也與本研究的結(jié)果一致，表現(xiàn)為河川沙塘鱧DMRT1基因在精巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于卵巢中表達(dá)量，這說明DMRT1基因僅在精巢的發(fā)育過程中起到了重要的作用。此外，周楠［18］對烏鱧的研究結(jié)果表明，DMRT1在卵巢中的表達(dá)量約為精巢的1／6，在肌肉、肝、心、鰓等組織中的表達(dá)量較少且無明顯的雌雄差異。而在本實驗中DMRT1基因在精巢中大量表達(dá)，在卵巢、心臟、肌肉、肝中少量表達(dá)，在腸、腦、鰓、脾中幾乎不表達(dá)，這與烏鱧的研究結(jié)果基本一致，因此推測DMRT1基因在精巢的發(fā)生和功能維持上發(fā)揮作用［18］。

3．3 河川沙塘鱧DMRT1基因時空表達(dá)的差異性分析

DMRT1基因在不同魚類胚胎發(fā)育的不同時期廣泛表達(dá)。如DMRT1基因在青鳉胚胎發(fā)育早期持續(xù)表達(dá)［38］；李林等［39］在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）胚胎發(fā)育的各個階段都能檢測到DMRT1基 因 的 表 達(dá)；王 金 華［40］對 香 魚（Plecoglossus altivelis）研究發(fā)現(xiàn)，香魚從受精卵到孵化出膜的胚胎發(fā)育的各個階段中都能檢測到DMRT1基因的表達(dá)。在本研究中，河川沙塘鱧DMRT1基因在胚胎發(fā)育的各個時期都有表達(dá)，這種廣泛表達(dá)的特性與先前的研究結(jié)果一致，推測該基因在河川沙塘鱧胚胎發(fā)育過程中也扮演著重要角色。在硬骨魚中，原始生殖細(xì)胞（PGCs）最早發(fā)現(xiàn)于原腸胚時期［41］。河川沙塘鱧DMRT1基因的表達(dá)量在胚胎發(fā)育的不同時期呈先上升后下降的趨勢，在原腸胚時期達(dá)到最高，該表達(dá)模式與黃顙魚［39］、香魚［40］類似。因此推測，DMRT1基因在胚胎發(fā)育過程中的高表達(dá)可能與原始生殖細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)。

DMRT1基因在性腺不同時期的表達(dá)量存在明顯的時空差異性，如在銀漢魚（Odontesthes bonariensis）中，DMRT1于精子再次發(fā)生時表達(dá)量會增高［42］；虹鱒DMRT1在精子發(fā)生期的各個階段均能穩(wěn)定表達(dá)，而在精子成熟后表達(dá)量減少［43］；黃顙魚DMRT1基因在IV期精巢中的表達(dá)量最高，在V期（精子成熟期）及VI期（精子退化期）的表達(dá)量減少［39］。此外，DMRT1基因在胡子鲇［28］、黑鯛［33］的精巢Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期均能夠穩(wěn)定表達(dá)，而在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞大量存在時表達(dá)量顯著增強。以上研究說明，DMRT1基因在不同魚類性腺的不同時期其表達(dá)量存在差異。本實驗發(fā)現(xiàn)DMRT1基因在河川沙塘鱧精巢發(fā)育的各個時期表達(dá)量也存在差異且呈先下降后上升的趨勢，在精子成熟期（Ⅳ期）達(dá)到最大值，這與鱘魚DMRT1基因的表達(dá)趨勢類似［19］，推測DMRT1基因可能在精巢的發(fā)育和功能維持過程中起重要作用。至于DMRT1基因通過何種途徑發(fā)揮相關(guān)作用，有待今后更進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

河川沙塘鱧DMRT1基因具有保守的DM結(jié)構(gòu)域，該基因在精巢的發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)并在Ⅳ期精巢表達(dá)量最高，推測其可能與精巢的發(fā)育和功能維持密切相關(guān)。本實驗為河川沙塘鱧DMRT1基因功能的研究提供了理論依據(jù)，為其性別決定機制的研究奠定了基礎(chǔ)，也為探究河川沙塘鱧的全雄育種打下了基礎(chǔ)。