趙巍，吳兆偉，張喆，胡琴，王琳

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注射用鹽酸甲氯芬酯及有關(guān)物質(zhì)的毒性研究

趙巍，吳兆偉，張喆，胡琴，王琳

102206 北京市藥品檢驗所中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室

研究注射用鹽酸甲氯芬酯及有關(guān)物質(zhì)的小鼠異常毒性及細胞毒性。

預(yù)實驗確定給藥劑量，正式實驗 120 只小鼠隨機分組（雌雄各半，每組 12 只），給藥后連續(xù)觀察 30 min，記錄小鼠異常反應(yīng)情況。應(yīng)用小鼠肝臟細胞AML-12觀察藥物的細胞毒性。

鹽酸甲氯芬酯的雜質(zhì)根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為對氯苯氧乙酸類似物和膽堿類。對氯苯氧乙酸類似物具有鎮(zhèn)靜作用，且安全范圍高于鹽酸甲氯芬酯，膽堿類雜質(zhì)具有明顯的外周膽堿類反應(yīng)，具有刺激性毒性。各雜質(zhì)對注射用鹽酸甲氯芬酯的體外細胞毒性基本無影響。

鹽酸甲氯芬酯膽堿類雜質(zhì)毒性較高，需重點關(guān)注。該研究為制定注射用鹽酸甲氯芬酯質(zhì)量標準提供科學(xué)依據(jù)，提高臨床用藥的安全性及有效性。

甲氯芬酯； 異常毒性； 細胞毒性

注射用鹽酸甲氯芬酯為苯氧乙酸酯類中樞興奮藥，主要作用于大腦皮質(zhì)[1-3]，臨床上用于治療外傷性昏迷、酒精中毒、新生兒缺氧癥、兒童遺尿癥、意識障礙等[4-6]。不良反應(yīng)主要有睡眠差、惡心、納呆等，注射后偶見皮疹、頭痛現(xiàn)象[7-9]。由于鹽酸甲氯芬酯結(jié)構(gòu)中含有酯鍵，在水和醇溶液中極易降解，產(chǎn)生大量雜質(zhì)，嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量及臨床用藥的安全有效[10-12]。因此，對注射用鹽酸甲氯芬酯及其有關(guān)物質(zhì)的毒性研究尤為重要。

研究表明，注射用鹽酸甲氯芬酯的有關(guān)物質(zhì)主要為對氯苯氧乙酸（雜質(zhì) A）、對氯苯氧乙酸乙酯（雜質(zhì) C）和 N,N-二甲氨基乙醇（雜質(zhì) D），結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。其中，雜質(zhì) A 既是鹽酸甲氯芬酯的合成起始物料，又是其水解產(chǎn)物，在制劑中含量高達 1%；雜質(zhì) C 是原料藥合成中產(chǎn)生的酯交換產(chǎn)物；雜質(zhì) D 無紫外吸收，且在質(zhì)譜檢測器中檢出濃度較高[13]。為進一步確定有關(guān)物質(zhì)的雜質(zhì)限度，對該品種質(zhì)量風(fēng)險進行合理監(jiān)控，本研究分別采用小鼠模型和細胞模型對注射用鹽酸甲氯芬酯及含量大于 0.1% 的有關(guān)物質(zhì)進行毒性研究，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì) D 的毒性較高，需重點關(guān)注。本研究結(jié)果為科學(xué)監(jiān)管提供了有力的支撐，對注射劑仿制藥質(zhì)量一致性評價起到積極引導(dǎo)和示范作用。目前國內(nèi)尚未見有關(guān)研究報道。

圖 1 鹽酸甲氯芬酯及有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)

Figure 1 Structure of meclofenac hydrochloride and related substances

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥與儀器 鹽酸甲氯芬酯對照品（批號 100840-201402，含量 99.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)對照品對氯苯氧乙酸（批號 05621LT-1）購自北京百靈威科技有限公司；其余雜質(zhì)對照品均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所協(xié)助合成。輔料甘露醇（批號 361504002）由青島明月海藻集團有限公司提供；胰酶（批號 R001100）由 ThermoFisher 公司生產(chǎn)；雙抗（批號 SV30010）由美國 Hyclone 公司生產(chǎn)；標準胎牛血清（批號 12484-010）由美國 Gibco 公司生產(chǎn)。實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。主要儀器為美國 BioTek 公司 mQunt 酶標儀。

1.1.2 實驗動物 昆明種小鼠，SPF 級，雌雄各半，體重 18 ~ 22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號 SCXK-(軍)2012-0004。飼養(yǎng)溫度為 22 ~ 26 ℃，自然采光照明，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 小鼠異常毒性實驗 異常毒性有別于藥物本身所具有的毒性特征，是指由生產(chǎn)過程中引入或其他原因所致的毒性[14]。本研究中設(shè)計的異常毒性實驗，即給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時間內(nèi)觀察實驗動物出現(xiàn)的異常反應(yīng)情況，進而對供試品中是否存在不安全因素進行評價。

鹽酸甲氯芬酯經(jīng)小鼠靜脈注射的 LD50為 330 mg/kg，依據(jù)美國科學(xué)院毒性物質(zhì)劃分等級，50 mg/kg < LD50< 500 mg/kg 屬于中等毒性，且具有急性毒性，小鼠口服的 LD50為 1750 mg/kg。鹽酸甲氯芬酯的臨床注射劑量為靜脈滴注成人一次 0.1 ~ 0.25 g，一日 3 次，即成人單次劑量為 1.7 ~ 4.2 mg/kg（按成人 60 kg 體重計）。依據(jù)人體給藥劑量及《中國藥典》2015 版四部異常毒性檢查法要求，設(shè)計鹽酸甲氯芬酯的小鼠基準劑量為5 mg/kg，即大于人體單次最高給藥劑量。經(jīng)預(yù)試，在此基準劑量下，出現(xiàn)明顯不同于空白對照動物的行為表現(xiàn)。因此，確定注射用鹽酸甲氯芬酯的小鼠給藥劑量為 5 mg/kg。鹽酸甲氯芬酯有關(guān)物質(zhì)給藥量的計算，依據(jù)雜質(zhì)的分子量與鹽酸甲氯芬酯的分子量進行折算后，分別為：雜質(zhì) A 3.2 mg/kg，雜質(zhì) C 3.6 mg/kg，雜質(zhì) D 1.5 mg/kg，所有樣品及空白對照均用 0.5% 的吐溫 80 溶液溶解后靜脈注射。小鼠隨機分組，每組 12 只，給藥后觀察小鼠的異常反應(yīng)，并對毒性進行評價。

1.2.2 細胞毒實驗 將處于指數(shù)生長期的小鼠正常肝臟 AML-12 細胞用胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，計數(shù)后稀釋至 1 × 105個/ml，接種于 96 孔板中，每孔加入 100 μl 細胞混懸液，置 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。

將鹽酸甲氯芬酯及其雜質(zhì)受試物用 DMSO 溶解、然后依次稀釋成多個梯度濃度，同時設(shè)陰性對照。取小鼠正常肝臟細胞株 AML-12 與用 DMSO 稀釋的樣品置 96 孔板中，在 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。樣品濃度分別為 0.01、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 和 200 mmol/L。孵育 48 h 后，取出 96 孔板，每孔中加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液 10 μl，置 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 時。取出，倒掉上清液，每孔加入 150 μl DMSO，置振蕩器上在常溫下輕度振蕩 10 min，酶標儀 570 nm 和 630 nm 波長下測定吸光度（）差值（570nm–630nm）。

細胞生長抑制率%（IR）= 100% –[（受試物/溶媒對照）× 100%]

統(tǒng)計得回歸方程，求半數(shù)抑制率（IC50），即 IR 為 50% 的藥物濃度。

2 結(jié)果

2.1 小鼠異常反應(yīng)及毒性評價

鹽酸甲氯芬酯雖然為中樞興奮藥，但是通過減少外周消耗，來促進腦內(nèi)代謝，因此在引起中樞興奮作用的同時，外在表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜。圖 2A為甲氯芬酯特征反應(yīng)，小鼠注射鹽酸甲氯芬酯后俯臥不動，時間持續(xù)約 30 min。

鹽酸甲氯芬酯的雜質(zhì)根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為兩類，一類是對氯苯氧乙酸類似物，包括雜質(zhì) A 和雜質(zhì) C，一類是膽堿類，包括雜質(zhì) D。小鼠注射雜質(zhì) A 和雜質(zhì) C 后，活動均稍有減弱，且反應(yīng)恢復(fù)較快（圖 2B）。由實驗結(jié)果可知，對氯苯氧乙酸類似物具有鎮(zhèn)靜作用，且安全范圍高于鹽酸甲氯芬酯，因此可根據(jù)產(chǎn)品能達到的水平確定雜質(zhì)限度。圖 2C為外周膽堿特征反應(yīng)，小鼠注射雜質(zhì) D 后具有明顯的外周膽堿類反應(yīng)。膽堿類成分刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚，注射時可能導(dǎo)致明顯的血管刺激反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，膽堿類雜質(zhì)毒性強于對氯苯氧乙酸類似物，建議建立稍微嚴格的有關(guān)物質(zhì)限度標準。

圖 2 甲氯芬酯及外周膽堿特征反應(yīng)（A：甲氯芬酯特征反應(yīng)；B：對氯苯氧乙酸類似物反應(yīng)；C：外周膽堿特征反應(yīng)）

Figure 2 Meclofenate and peripheral choline characteristics (A: Meclofenate; B: p-chlorophenoxyacetic acid analog; C: Peripheral choline)

表 1 鹽酸甲氯芬酯及有關(guān)物質(zhì)異常反應(yīng)及毒性評價

通過比較有無輔料情況下，注射鹽酸甲氯芬酯后小鼠的異常反應(yīng)結(jié)果（表1）可知，含輔料樣品出現(xiàn)反應(yīng)的時間略有延遲，且持續(xù)時間較短。說明輔料甘露醇會影響主成分作用發(fā)揮的速度和持續(xù)時間。因此，在使用過程中，建議選擇不含輔料的制劑類型，以保障臨床用藥的療效。

2.2 細胞毒性評價

實驗結(jié)果表明（表2），孵育 48 h 后鹽酸甲氯芬酯及水解雜質(zhì)的毒性基本一致，達到半數(shù)抑制率時樣品濃度均大于 100 μmol/L，醇解雜質(zhì)的毒性略高，達到半數(shù)抑制率時樣品濃度為 83.54 μmol/L，但無顯著性差異。因此，各雜質(zhì)對注射用鹽酸甲氯芬酯的體外細胞毒性基本無影響。

表 2 細胞毒性結(jié)果

2.3 有關(guān)物質(zhì)限度研究

由小鼠異常毒性和細胞毒性結(jié)果可知，鹽酸甲氯芬酯的有關(guān)物質(zhì)中，雜質(zhì) D 具有明顯的外周膽堿作用，其毒性強于雜質(zhì) A 和 C，還可能導(dǎo)致注射時出現(xiàn)明顯的血管刺激反應(yīng)，因此建議制定較為嚴格的有關(guān)物質(zhì)限度標準。雜質(zhì) D 無紫外吸收，且在質(zhì)譜檢測器中檢出濃度較高，在 TLC 中難以達到精準定量的要求，不適合常規(guī)檢測器的測定。根據(jù)鹽酸甲氯芬酯水解反應(yīng)機制及文獻[15]可知，雜質(zhì) D 與雜質(zhì) A 等比例生成，故在無法準確測定雜質(zhì) D 的情況下，可通過雜質(zhì) A 的含量來控制水解雜質(zhì)的生成量。雖然醇解反應(yīng)也產(chǎn)生雜質(zhì) D，但樣品中水解雜質(zhì)含量是醇解雜質(zhì)含量的 7 ~ 70倍，因此雜質(zhì) D 主要來源于水解反應(yīng)?；谏鲜隹紤]，擬對水解雜質(zhì) A 進行單獨控制，并參考 ICH 的相關(guān)要求[16]，建議將其限度定為：不得超過 0.2%。

3 討論

本研究中，分別采用小鼠模型和細胞模型對注射用鹽酸甲氯芬酯及其有關(guān)物質(zhì)進行毒性研究，發(fā)現(xiàn)膽堿類雜質(zhì)毒性較高，需重點關(guān)注，以減少藥物的不良反應(yīng)，降低臨床用藥的風(fēng)險。通過研究，還確認了注射用鹽酸甲氯芬酯高風(fēng)險雜質(zhì)及質(zhì)量控制關(guān)鍵步驟，指導(dǎo)企業(yè)優(yōu)化相應(yīng)的生產(chǎn)工藝，提升了產(chǎn)品質(zhì)量，為科學(xué)監(jiān)管提供技術(shù)保障和執(zhí)法依據(jù)，促進了國產(chǎn)仿制藥質(zhì)量的不斷提高，加強了對高風(fēng)險注射劑品種的風(fēng)險防控，為注射劑的仿制藥質(zhì)量一致性評價提供有力的技術(shù)支撐。

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Study on the toxicity of meclofenac hydrochloride for injection and related substances

ZHAO Wei, WU Zhao-wei, ZHANG Zhe, HU Qin, WANG Lin

Beijing Institute for Drug Control, Beijing Key Laboratory of Analysis and Evaluation on Chinese Medicine, Beijing 102206, China

To study the abnormal toxicity in mice and cytotoxicity of meclofenac hydrochloride for injection and related substances.

In the preliminary experiment to determine the initial dose, the mice were grouped randomly (half male and half female, 12 mice per group) in the formal experiment. The animal reactions were recorded for 30 minutes. The cytotoxicities on mouse liver cells AML-12 were measured.

The impurities of meclofenac hydrochloride can be divided into p-chlorophenoxyacetic acid analogues and choline bases according to the structure. The former has a sedative effect and the safety range is higher than that of meclofenac hydrochloride. Choline impurities have obvious peripheral choline response and high toxicity. The impurities had no effect on thecytotoxicity of meclofenac hydrochloride for injection.

The toxicity of choline impurities is high and attention must be paid to monitor of the related substances of meclofenac hydrochloride for injection, to improve the safety and effectiveness of clinical medications.

Meclofenoxate; Abnormal toxicity; Cytotoxicity

WANG Lin, Email: lindawang2225@163.com

王琳，Email：lindawang2225@163.com

2018-07-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.009