王蓉，李良，張勝華，甄永蘇，苗慶芳

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抗人CD30單克隆抗體的制備和活性研究

王蓉，李良，張勝華，甄永蘇，苗慶芳

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

制備抗人 CD30 單克隆抗體并進(jìn)行活性研究，為其作為抗體偶聯(lián)藥物的靶向運輸載體提供研究依據(jù)。

通過基因工程技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體 pIZDHL-CD30-IgG，將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO/dhFr-細(xì)胞并篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá) anti-CD30-IgG 抗體的細(xì)胞株并純化抗體，通過 HPLC 檢測其純度。ELISA、Biacore 和流式細(xì)胞術(shù)實驗檢測 anti-CD30-IgG 的親和活性；免疫熒光共聚焦實驗觀察其在腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞情況；利用小動物活體成像技術(shù)研究抗體在 NOD/SCID 鼠移植瘤模型中的靶向性。

成功構(gòu)建了 anti-CD30-IgG 抗體的表達(dá)載體，并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株 CHO-CD30-IgG，純化后的抗體 anti-CD30-IgG 純度達(dá)到 98% 以上。Anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原具有很好的親和活性，親和常數(shù)為 4.15 × 108L/mol，其可通過腫瘤細(xì)胞表面 CD30 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。在 NOD/SCID 小鼠 L540 和 Karpas299 移植瘤模型中，anti-CD30-IgG 可以選擇性地富集并滯留在腫瘤部位。

Anti-CD30-IgG 對抗原和腫瘤細(xì)胞具有高親和性和特異性，并且可被內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，在小鼠體內(nèi)可選擇性靶向并且長時間滯留在腫瘤部位，可作為抗體偶聯(lián)藥物中“彈頭”部分的靶向輸送載體。

抗原，CD30； 抗體，單克??； 霍奇金?。?大細(xì)胞，間變性

霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）和間變性大細(xì)胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是惡性血液腫瘤且在青少年中發(fā)病率較高。隨著化療、放療等一線治療技術(shù)的發(fā)展，HL 和 ALCL 治療取得了重大進(jìn)展，但仍有約 10% 的 HL 患者和 40% ~ 60% 的ALCL患者對一線治療無應(yīng)答或治療后復(fù)發(fā)，需要接受自體造血干細(xì)胞移植（autologous hematopoietic stem-cell transplantation，ASCT）[1-2]。雖然 ASCT 在復(fù)發(fā)性和難治性淋巴瘤的治療中表現(xiàn)為較好的治愈率，但仍有約 50% 的患者經(jīng)二次治療后復(fù)發(fā)，后續(xù)治療愈加困難[3]。因此，復(fù)發(fā)性和難治性 HL 和 ALCL 仍是血液腫瘤治療的重點和難題。

CD30 是腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）成員之一，屬于 I 型跨膜糖蛋白，在多種惡性血液瘤中過表達(dá)，包括 HL 和 ALCL[4]。CD30 低表達(dá)于非病理狀態(tài)下活化的 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞表面，而在正常細(xì)胞不表達(dá)[5]。CD30 在腫瘤細(xì)胞的高度特異性和選擇性表達(dá)使其成為抗體靶向藥物的理想靶點，而以 CD30 為靶點的單克隆抗體及抗體偶聯(lián)藥物的發(fā)展為 HL 和 ALCL等惡性血液腫瘤的治療提供了新策略。SGN-30 是靶向 CD30 的嵌合抗體，其通過抗體依賴的細(xì)胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）在體內(nèi)發(fā)揮較好的抗腫瘤效果[6]，而抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）SGN-35（brentuximab vedotin，BV）是由 SGN-30 通過連接肽與微管抑制劑 MMAE 偶聯(lián)而成，已獲美國 FDA 批準(zhǔn)上市并在臨床上取得了突出療效[7-8]。盡管如此，在復(fù)發(fā)性或難治性 HL 患者的臨床試驗中，BV 治療顯示中位無進(jìn)展生存期不到 10 個月，而五年無進(jìn)展生存率僅為22%[9-10]。在一項隨機、雙盲、控?zé)煹娜谂R床試驗中，經(jīng) BV 治療出現(xiàn)外周感覺神經(jīng)病變的患者占 50% 以上[11]。此外，有報道表明，其“彈頭”藥物 MMAE 導(dǎo)致的耐藥性是患者對 BV 治療產(chǎn)生耐藥性的主要因素之一[12]。因此，以 CD30 為靶點研發(fā)新型針對 HL 和 ALCL 的抗體及 ADCs 具有重要意義。

本研究構(gòu)建了以 CD30 為靶點的抗體 anti-CD30-IgG 并實現(xiàn)了其在 CHO 細(xì)胞的高效表達(dá)，進(jìn)一步研究了該抗體與 CD30 抗原和腫瘤細(xì)胞的親和性和特異性，以及其在小鼠移植瘤模型中的腫瘤靶向性，為其作為抗體偶聯(lián)藥物的靶向運輸載體提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO/dhFr-細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；人霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系 L540 和 L428 購自美國 Creative Bioarray 公司；人間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系 Karpas299 和 SU-DHL-1 購自北京博奧派克生物科技有限公司；人 Burkitt 淋巴瘤細(xì)胞系 Raji 由本室傳代保存。

1.1.2 主要試劑 T4 DNA 連接酶及限制性內(nèi)切酶系列產(chǎn)品均購自美國 NEB 公司；DAPI 購自北京索萊寶生物科技有限公司；重組人 CD30 蛋白（Catalog # 6126-CD）購自美國 R&D Systems 公司；胎牛血清（FBS）為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；FITC 標(biāo)記山羊抗人抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Alexa Fluor 488 標(biāo)記羊抗人 IgG（Fcγ特異性）抗體購自美國 Jackson Immuno Research 公司；山羊抗人 IgG（γ 鏈特異性）、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗人 IgG（Fc 特異性）抗體購自 Sigma 公司；BCA 試劑盒和 DyLight 680 抗體標(biāo)記試劑盒購自美國 Thermo Scientific 公司；尼妥珠單抗購自百泰生物藥業(yè)有限公司。

1.1.3 耗材 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自美國 Corning 公司；PD-10 脫鹽柱、抗體純化柱子 Protein G HP 為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；超濾離心管購自美國 Millipore 公司。

1.1.4 質(zhì)粒 抗體表達(dá)質(zhì)粒 pIZDHL 由美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心劉小云博士惠贈。

1.1.5 實驗動物 18 ~ 22 g 雌性 NOD/SCID 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在 SPF 環(huán)境中。所有受試動物均可自由進(jìn)水和攝食，所有實驗均按照國際公認(rèn)的實驗動物照料和使用原則進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 Anti-CD30-IgG 的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列設(shè)計 Anti-CD30-IgG 抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）序列來自 anti-CD30 抗體 AC10 的 VH 和 VL 序列（美國專利 Pub. No. US2008/0267976 A1），分別在其 5' 端加入 Kozak 序列（GCCACC）和信號肽序列（輕鏈信號肽ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC；重鏈信號肽ATGGGTTGGTCTTGTATTATCCTGT TCCTGGTCGCTACCGCCACTGGGGTCCACTCA），以增強基因的翻譯效率和蛋白的分泌表達(dá)。此外，VL 基因兩端加入I 和WI 酶切位點，VH 基因兩端加入I 和I 酶切位點。上述基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將 VL 基因序列經(jīng)

I 和W I 雙酶切后，用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物分離，切下 250 ~ 500 bp 之間區(qū)域的目的 DNA 片段，并用 DNA 膠回收試劑盒純化線性目的片段。使用 T4 DNA 連接酶連接 VL 基因片段和經(jīng)I 和W I 雙酶切后的真核表達(dá)載體 pIZDHL，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并酶切驗證 VL 基因是否成功連接，正確的質(zhì)粒命名為 pIZDHL-VL。將質(zhì)粒 pIZDHL-VL 和 VH 基因分別以I 和I 雙酶切，使用 T4 DNA 連接酶連接雙酶切后的基因片段，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并酶切驗證 VL 和 VH 基因是否分別連接上，并測序驗證序列的正確性。將測序正確的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，將重組質(zhì)粒命名為 pIZDHL-CD30-IgG。

1.2.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 CHO/dhFr-細(xì)胞 將質(zhì)粒 pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)I 酶切線性化后回收，采用 Lipofectamine 3000 試劑盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO/dhFr-細(xì)胞，然后加入博來霉素進(jìn)行篩選，同時培養(yǎng)基中去除次黃嘌呤和胸腺嘧啶。由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上有博來霉素抗性基因和二氫葉酸還原酶基因，只有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并整合到基因組上的細(xì)胞才能生存。經(jīng) 2 ~ 3 周的篩選，存活的細(xì)胞團(tuán)即為陽性細(xì)胞，挑選表達(dá)量較高的陽性細(xì)胞運用博來霉素和有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選。

1.2.4 ELISA 法篩選高表達(dá)細(xì)胞株 運用雙抗體夾心 ELISA 測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體濃度。96 孔板包被羊抗人 IgG（γ 鏈特異性）抗體并用 2% BSA 封閉。標(biāo)準(zhǔn)品為人源化抗體尼妥珠單抗，將待測細(xì)胞培養(yǎng)上清和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入包被的 96 孔板，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗 3 次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人 IgG（Fc 特異性）二抗，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗 3 次，加入顯色底物 p-NPP 試劑，室溫孵育 5 ~ 10 min，于酶標(biāo)儀檢測 405 nm 處的吸光度值。從中篩選出抗體表達(dá)量最高的一株細(xì)胞命名為 CHO-CD30-IgG，進(jìn)行擴大培養(yǎng)，其表達(dá)的抗體命名為 anti-CD30-IgG。

1.2.5 Anti-CD30-IgG 的純化和鑒定 將細(xì)胞株 CHO-CD30-IgG 擴大培養(yǎng)，待其在 T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)密度達(dá)到 90% 以上，1:2 的比例轉(zhuǎn)入新的 T75 培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng) 24 h，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)基（CD OptiCHOTM培養(yǎng)液 +2 mmol/L L-谷氨酰胺），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng) 10 d 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，通過 Protein G 親和層析柱分離純化蛋白。將純化后的抗體通過 SDS-PAGE 凝膠電泳和 HPLC 法檢測抗體的純度，并用 BCA 試劑盒（標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清免疫球蛋白 BGG）測定抗體的濃度。

1.2.6 ELISA 法檢測 anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和活性 96 孔板包被重組人 CD30 抗原，濃度分別為 0.2、0.4 和 0.8 μg/ml，并用 2% BSA 封閉。加入梯度稀釋的 anti-CD30-IgG，37 ℃孵育 1 h。后續(xù)步驟同 1.2.4 所述。

1.2.7 Biacore 實驗檢測 anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和常數(shù) 將 CM5 芯片偶聯(lián)山羊抗人 IgG，使其可以捕獲抗體的 Fc 段，將抗體用 HEPES 緩沖液稀釋到 1 μg/ml 并富集到芯片上。用 pH 4.5 的醋酸鈉緩沖溶液倍比稀釋 CD30 抗原，終濃度分別為 65、32.5、16.25、8.13、4.06 和 2.03 nmol/L。利用 Biacore 儀器將抗原濃度從高到低依次流過抗體表面使其結(jié)合，每個濃度完成后用 3 mol/L MgCl2溶液洗脫抗原和抗體，再重新富集抗體隨后加入抗原與之結(jié)合、解離（流速為30 μl/min）。用 Biacore T200 計算軟件處理實驗結(jié)果，得出抗原-抗體相互作用的結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)以及親和常數(shù)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)法檢測 anti-CD30-IgG 與腫瘤細(xì)胞的親和活性 將 200 μl細(xì)胞懸液（3 × 105個細(xì)胞）與梯度稀釋的 anti-CD30-IgG 溶液 4 ℃共孵育 1 h，1500 r/min 離心 5 min，棄上清。PBS 洗滌兩次后，加入FITC 標(biāo)記的羊抗人 IgG 于 4 ℃避光孵育 1 h，1500 r/min 離心 5 min，棄上清。PBS 洗滌兩次后用 500 μl PBS 重懸細(xì)胞，300 目尼龍濾網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀檢測熒光強度。

1.2.9 免疫熒光共聚焦實驗檢測 anti-CD30-IgG 與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合及內(nèi)吞活性 將處于對數(shù)生長期的 Karpas299、L540 和 Raji 細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整其濃度，按每孔 3 × 104個細(xì)胞分別接種于 96 孔板中，37 ℃培養(yǎng) 2 h 后加入 CD30-IgG-LDP，終濃度為 5 μg/ml，4℃孵育30 min 或 37 ℃孵育 24 h 檢測其與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合及內(nèi)吞情況。收集細(xì)胞樣品，PBS 洗 2 次，用細(xì)胞甩片機將細(xì)胞離心至載玻片上，4% 多聚甲醛固定 10 min，PBST 洗 3 次，0.2% TritonX-100 溶液（溶劑為 PBS）透化 10 min，PBST 洗 3 次，用 5% 的羊血清室溫封閉 2 h。滴加 Alexa Fluor488標(biāo)記的抗人熒光二抗于 37 ℃孵育 30 min，PBST 洗 3 次，DAPI 染細(xì)胞核 15 min，PBST 洗 3 次，滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片并用指甲油將蓋玻片四周封閉，晾干后于免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.10 小動物活體成像技術(shù)檢測 anti-CD30-IgG的體內(nèi)腫瘤靶向能力 將霍奇金淋巴瘤細(xì)胞 L540 和間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞 Karpas299 計數(shù)調(diào)整至 2.5 × 107個/ml，接種至 NOD/SCID 鼠右側(cè)腋下，每只接種 200 μl。當(dāng)腫瘤體積至 200 ~ 400 mm3，將 DyLight 680 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG 抗體通過尾靜脈注射入荷瘤小鼠體內(nèi)（n = 2），注射劑量為 20 mg/kg。在給藥后選擇一系列時間點，利用 XENGOEN小動物活體成像儀進(jìn)行觀察并于不同時間點監(jiān)測標(biāo)記抗體在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的鑒定

pIZDHL 和 pIZDHL-CD30-IgG 質(zhì)粒示意圖如圖 1 所示。對構(gòu)建的表達(dá)載體 pIZDHL-CD30-IgG 分別經(jīng)I、WI 雙酶切和I、I 雙酶切鑒定，結(jié)果如圖 2 所示。VL 和 VH 基因片段的理論長度分別為 414 bp 和 426 bp，pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)雙酶切后，VL 和 VH 片段的電泳條帶在 400 bp 左右，與預(yù)期一致。

2.2 ELISA 篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞株

將成功轉(zhuǎn)染并經(jīng) ELISA 鑒定成功表達(dá)目標(biāo)抗體的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，從有限稀釋的 96 孔板中挑選形態(tài)較好的單克隆進(jìn)行擴大培養(yǎng)。每種單克隆細(xì)胞計數(shù)后，取 2 × 105個細(xì)胞在 1 ml 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 96 h，然后取其上清用 ELISA 方法檢測目的抗體 anti-CD30-IgG 的表達(dá)量。如圖 3 所示，101 株單克隆細(xì)胞都表達(dá)抗體 anti-CD30-IgG，表達(dá)量各有差異，其中 63 號單克隆細(xì)胞抗體表達(dá)量在 12 mg/L以上，明顯高于其他單克隆細(xì)胞，將此細(xì)胞株命名為 CHO-CD30-IgG 并進(jìn)行擴大培養(yǎng)。

圖 1 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（A：pIZDHL；B：pIZDHL-CD30-IgG）

Figure 1 Schematic diagrams of plasmids (A: pIZDHL; B: pIZDHL-CD30-IgG)

M1：DL15000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2：DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1~2：pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)Mlu I、BsiWI 雙酶切鑒定 VL 片段；3~4：pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)Xho I、Nhe I 雙酶切鑒定 VH 片段

Figure 2 Determination of plasmid pIZDHL-CD30-IgG by agarose gel electrophoresis (A: Analysis of pIZDHL-CD30-IgG after being digested withI andWI; B: Analysis of pIZDHL-CD30-IgG after being digested withI andI)

圖 3 不同單克隆細(xì)胞中 anti-CD30-IgG 表達(dá)量的篩選結(jié)果

Figure 3 The expression levels of anti-CD30-IgG in single cell clones

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：Anti-CD30-IgG 非還原電泳條帶；2：Anti-CD30-IgG 還原電泳條帶；WB：抗人 IgG 二抗探針檢測抗體重鏈和輕鏈的結(jié)果

M: Protein marker; 1: Anti-CD30-IgG under non-reducing condition; 2: Anti-CD30-IgG under reducing condition; WB: Heavy chains and light chains detected by anti-human IgG

圖 4 SDS-PAGE、Western blot（A）和 HPLC（B）分析 anti-CD30-IgG 的表達(dá)純化結(jié)果

Figure 4 Analysis of purified anti-CD30-IgG by SDS-PAGE, Western blot (A) and HPLC (B)

圖 5 ELISA（A）、Biacore（B）和流式細(xì)胞術(shù)法（C）檢測 anti-CD30-IgG 的親和活性

Figure 5 Binding affinity analysis of anti-CD30-IgG by ELISA (A), Biacore (B) and flow cytometry (C)

2.3 Anti-CD30-IgG 的純化和純度分析

將對數(shù)生長期的 CHO-CD30-IgG 細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 10 d 后收集上清，上清中的抗體經(jīng) Protein G 親和層析柱純化，抗體產(chǎn)量約為 20 mg/L。利用 SDS-PAGE 凝膠電泳鑒定抗體的純度和結(jié)構(gòu)，如圖 4A 所示，非還原狀態(tài)下，抗體為單一的完整條帶，分子量在 150 kD 左右；還原狀態(tài)下，抗體鏈間二硫鍵斷裂，表現(xiàn)為輕鏈和重鏈兩條帶，分子量在 25 kD 和 50 kD 左右，與理論大小相符。通過 HPLC 更加直觀地檢測抗體的純度，在 280 nm 波長下顯示為單一蛋白峰，其純度在 98% 以上（圖 4B）。

2.4 Anti-CD30-IgG 的親和活性分析

2.4.1 Anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和活性 ELISA 實驗檢測anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的結(jié)合活性。如圖 5A 所示，不同濃度的 anti-CD30-IgG 分別與 0.2、0.4 和 0.8 μg/ml CD30 結(jié)合，均呈現(xiàn)典型的 S 型曲線，在抗原-抗體結(jié)合未飽和情況下，其相互結(jié)合具有抗體濃度依賴性和抗原濃度依賴性。進(jìn)一步通過 Biacore 實驗計算抗原-抗體的親和常數(shù)，兩者的結(jié)合、解離曲線如圖 5B 所示，anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和速率常數(shù)（k）為 4.61 × 105L/(mol·s)，解離速率常數(shù)（k）為 1.10 × 10-3/s，親和常數(shù)（K=k/k）為 4.15 × 108L/mol。

圖 6 Anti-CD30-IgG 與 L540 細(xì)胞（A）、Karpas299（B）、Raji 細(xì)胞（C）的結(jié)合和內(nèi)吞（× 630）（4 ℃ 下 Anti-CD30-IgG 與 CD30 陽性的 L540 細(xì)胞、Karpas299 細(xì)胞表面結(jié)合，37 ℃ 下被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞；與 CD30 陰性的 Raji 細(xì)胞無結(jié)合；綠色熒光 Alexa Fluor 488 標(biāo)記 anti-CD30-IgG）

Figure 6 Binding and internalization of anti-CD30-IgG by L540 (A)，Karpas299 (B) and Raji cells (C) (× 630) [Cell surface binding of anti-CD30-IgG was shown by incubating L540 and Karpas299 with Alexa Fluor 488-labeled anti-CD30-IgG (green) at 4 ℃ and internalization was allowed by incubating at 37 ℃; No binding of anti-CD30-IgG was detected when incubated with the CD30-negative Raji cells]

2.4.2 Anti-CD30-IgG 與腫瘤細(xì)胞的親和活性 流式細(xì)胞術(shù)法檢測不同濃度的anti-CD30-LDP（0.001 ~ 3 μg/ml）與 CD30 表達(dá)量不同的腫瘤細(xì)胞的親和活性。本實驗選取霍奇金淋巴瘤 L540 和 L428、間變性大細(xì)胞淋巴瘤 Karpas299 和 SU-DHL-1 及人 Burkitt 淋巴瘤細(xì)胞系 Raji，其中 L540 和 Karpas299 細(xì)胞 CD30 表達(dá)量較高，SU-DHL-1 和 L428 細(xì)胞 CD30 表達(dá)量較低，而 Raji 細(xì)胞不表達(dá) CD30[13]。如圖 5C 所示，anti-CD30-IgG 與 CD30 陽性細(xì)胞具有很好的結(jié)合能力，其結(jié)合能力的強弱與細(xì)胞表面抗原 CD30 的表達(dá)量有關(guān)。此外，anti-CD30-IgG 與 CD30 陰性細(xì)胞 Raji 不結(jié)合，表明其與抗原或細(xì)胞的識別具有特異性。

2.5 Anti-CD30-IgG 通過內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞

通過免疫熒光共聚焦實驗觀察 anti-CD30-IgG 在腫瘤細(xì)胞的定位。如圖 6 所示，4 ℃共孵育條件下，anti-CD30-IgG 可與 L540 和 Karpas299 細(xì)胞表面結(jié)合，而與 Raji 細(xì)胞不結(jié)合，表明 anti-CD30-IgG 可特異性地與抗原 CD30 結(jié)合。而在 37 ℃共孵育條件下，L540 和 Karpas299 細(xì)胞內(nèi)可觀察到綠色熒光顆粒（Alexa Fluor 488 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG），表明抗體可通過細(xì)胞表面 CD30 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。

2.6 Anti-CD30-IgG 在小鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性

利用小動物活體熒光成像技術(shù)實時監(jiān)測 anti-CD30-IgG 分別在 NOD/SCID 鼠 Karpas299 和 L540 移植瘤模型中的分布和富集情況。如圖 7 所示，尾靜脈注射后 6 h，DyLight 680 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG 在腫瘤部位開始富集。在 L540 小鼠移植瘤模型中，12 ~ 96 h 熒光信號富集程度較強，96 h 左右熒光開始減弱，腫瘤部位的熒光信號可持續(xù) 5 d 以上。而 Karpas299 小鼠移植瘤模型中，熒光信號的富集時間相對較短，48 h 后熒光開始減弱，但仍可持續(xù) 3 d 以上。以上結(jié)果表明，在小鼠移植瘤模型中，anti-CD30-IgG 可以選擇性地富集并滯留在腫瘤部位，提示 anti-CD30-IgG 可作為化療藥物的靶向輸送載體。

3 討論

近十幾年，腫瘤靶向性單克隆抗體的發(fā)展改變了惡性腫瘤治療的模式。但是，大多數(shù)單抗藥物單獨使用抗腫瘤活性有限，而 ADCs 是將單克隆抗體與高效細(xì)胞毒藥物通過化學(xué)接頭連接在一起，由于具有高效、低毒的特點使其在腫瘤治療領(lǐng)域越來越受到關(guān)注[10, 14]。在 ADCs 的研究中，選擇合適的靶點和有效的抗體是首要環(huán)節(jié)。

作為靶點的抗原需是在腫瘤細(xì)胞過表達(dá)或特異性表達(dá)，具有細(xì)胞外表位，并且與特異性抗體結(jié)合后可被內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)從而使得“彈頭”藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞毒作用，這些都是 ADCs 發(fā)揮抗腫瘤活性和實現(xiàn)機體耐受性的重要條件[15-16]。CD30 抗原在 HL 和 ALCL 細(xì)胞的特異性表達(dá)使其成為 ADCs 的理想靶點，靶向 CD30 的 ADC 藥物 BV 在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)了良好的治療效果和安全性[8-9]。本研究通過已知的可變區(qū)序列，構(gòu)建并篩選得到重組抗 CD30 的嵌合抗體 anti-CD30-IgG，體外實驗證明其與重組人 CD30 抗原和 CD30 陽性腫瘤細(xì)胞都具有很好的特異性和親和性，并且可通過受體CD30 介導(dǎo)的內(nèi)吞被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)。此外，在小鼠移植瘤模型中，anti-CD30-IgG 具有很好的腫瘤靶向性。以上研究結(jié)果均表明 anti-CD30-IgG 可作為新型 ADCs 的有效載體。

圖 7 小動物活體成像分析 DyLight 680 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG 在荷瘤鼠體內(nèi)的分布

Figure 7optical imaging of DyLight 680-labeled anti-CD30-IgG in L540 and Karpas299 xenografts

當(dāng)前，研發(fā)高效、低毒的腫瘤靶向性藥物已成為全球抗腫瘤藥物的發(fā)展趨勢，抗體藥物或抗體偶聯(lián)藥物由于其特異性和靶向性備受研究者青睞，而選擇具有較高腫瘤親和性和特異性的單克隆抗體是 ADCs 發(fā)揮高效、低毒活性關(guān)鍵因素之一。本研究制備了抗 CD30 單克隆抗體 anti-CD30-IgG，并證實其高效親和性、特異性、可被內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部和在小鼠體內(nèi)腫瘤靶向性等特點符合作為 ADCs 藥物高效運輸載體的條件。在此基礎(chǔ)上，我們下一步工作是將 anti-CD30-IgG 與高效“彈頭”藥物偶聯(lián)或融合制備新型 ADC，為 HL 和 ALCL 等血液惡性腫瘤的治療研發(fā)有發(fā)展前景的候選藥物。

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Preparation and activity study of an anti-CD30 monoclonal antibody

WANG Rong, LI Liang, ZHANG Sheng-hua, ZHEN Yong-su, MIAO Qing-fang

Author Affiliation: Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

The aim of this study is to prepare an anti-CD30 monoclonal antibody and investigate its activity, by which we provide an evaluation for its use as a drug carrier in antibody-drug conjugates.

The eukaryotic expression vector of pIZDHL-CD30-IgG was constructed by genetic engineering, and transfected into CHO/dhFr-cells to obtain the single cell clones which stably expressed the antibody of anti-CD30-IgG. Anti-CD30-IgG was purified using affinity chromatography and its purity was detected by HPLC. The antigen-binding activity of anti-CD30-IgG was analyzed by ELISA, Biacore and flow cytometry and its internalization in tumor cells was observed by immunofluorescence confocal microscopy. Thetumor-targeting ability of anti-CD30-IgG was monitored by living images.

In this study, we constructed the expression vector of anti-CD30-IgG and selected the CHO single cell clone which successfully expressed high level of anti-CD30-IgG. After purification, we obtained the antibody of anti-CD30-IgG with purity of more than 98%. Anti-CD30-IgG showed specific and high affinity binding to recombinant CD30 with the affinity constant of 4.15 × 108L/mol. Besides, it could bind to CD30+cancer cells and be internalized into target cells through the antigen-mediated endocytosis. Anti-CD30-IgG also exhibited excellent tumor-targeting capability in L540 and Karpas299 xenograft models.

Anti-CD30-IgG shows attractive specificity and affinity to CD30 antigen and it can be internalized into CD30+tumor cells. Anti-CD30-IgG selectively targets tumor tissues in NOD/SCID mice xenograft models. Taken together, anti-CD30-IgG is an appropriate targeted vehicle for the delivery of cytotoxic payloads in antibody-drug conjugates.

Antigens, CD30; Antibodies, monoclonal; Hodgkin disease; Large-cell, anaplastic

MIAO Qing-fang, Email: miaoqf@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.002

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2014ZX09201042-003）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-3-013）

苗慶芳，Email：miaoqf@sina.com

2018-05-09