鄒麗輝，王萌，黃薇，張恩毅，肖飛，王玉梅

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一種高效制備人β2微球蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法和應(yīng)用

鄒麗輝，王萌，黃薇，張恩毅，肖飛，王玉梅

100730 北京，北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心/衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點實驗室（鄒麗輝、黃薇、張恩毅、肖飛），檢驗科（王萌）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院生物材料室（王玉梅）

構(gòu)建重組人 β2 微球蛋白表達(dá)體系，高效快速獲取 β2 微球蛋白，為臨床實驗室檢測參考物質(zhì)的制備奠定基礎(chǔ)。

優(yōu)化人 β2 微球蛋白序列，人工合成優(yōu)化序列片段并與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）分別克隆至pRSF-Duet 載體以構(gòu)建重組人 β2 微球蛋白表達(dá)質(zhì)粒。使用大腸桿菌BL21(DE3) 對重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，TEV 蛋白酶切除 MBP，全自動生化儀測定 β2 微球蛋白濃度。對重組蛋白在 4 ℃和–20 ℃儲存條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，對 β2 微球蛋白純品與校準(zhǔn)品的互通性進(jìn)行分析。

成功構(gòu)建重組人 β2 微球蛋白表達(dá)質(zhì)粒，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）成功誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，MBP-β2 微球蛋白（MBP-β2-MG）濃度可達(dá) 100 mg/L，β2 微球蛋白濃度可達(dá) 185 mg/L。在 4 ℃和 –20 ℃儲存條件下監(jiān)測 64 周，β2 微球蛋白穩(wěn)定存在。β2 微球蛋白純品與 RANDOX 生化校準(zhǔn)品互通性良好。

通過密碼子優(yōu)化，成功構(gòu)建了重組 β2 微球蛋白的高效表達(dá)系統(tǒng)，β2 微球蛋白可溶性高，穩(wěn)定性好，與國際通用校準(zhǔn)品互通性好，可充分滿足該產(chǎn)品診斷試劑制備的需求。

β2微球蛋白； 重組蛋白質(zhì)類； 參考物質(zhì)

β2 微球蛋白是由淋巴細(xì)胞、血小板和其他大多數(shù)有核細(xì)胞產(chǎn)生的一種低分子量血清蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量為11 800，是由 99 個氨基酸組成的單鏈多肽。β2 微球蛋白廣泛存在于血漿、尿液、腦脊液、唾液以及初乳中。正常人 β2 微球蛋白的合成率及從細(xì)胞膜上的釋放量相當(dāng)恒定，并且極易通過腎小球濾過膜，濾過的 β2 微球蛋白 99.9% 被近曲小管細(xì)胞重吸收和降解，不再返流入血。當(dāng)腎小球或腎小管濾過功能受損，尿液和血清中的 β2 微球蛋白增高[1-2]。β2 微球蛋白的調(diào)控異常可直接參與癌細(xì)胞的發(fā)育，被認(rèn)為是多種惡性腫瘤的預(yù)后指標(biāo)[3-4]。臨床上檢測血或尿中的β2 微球蛋白濃度為臨床腎功能測定、腎移植成活、糖尿病腎病、重金屬鎘、汞中毒以及某些惡性腫瘤的臨床診斷提供較早、可靠和靈敏的指標(biāo)。腦脊液中β2 微球蛋白的濃度檢測對腦膜白血病也有提示作用。

目前臨床上測定β2 微球蛋白的方法有放射免疫分析法（RIA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、時間分辨熒光免疫分析法等[5]。臨床實驗室使用的β2 微球蛋白參考物質(zhì)多從人血清中提取，成本高，產(chǎn)率低，有時特異性和穩(wěn)定性較差。此外，大多數(shù)血清β2 微球蛋白高的血清樣本來自患有自身免疫性疾病或腫瘤患者。因此，從大腸桿菌中表達(dá)和純化更高濃度的可溶性 β2 微球蛋白，可為臨床實驗室提供更優(yōu)質(zhì)、更廉價的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

本研究利用原核表達(dá)的方法，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒 pMBP-β2-MG pRSF，在大腸桿菌中表達(dá)。大腸桿菌是一種應(yīng)用廣泛的表達(dá)載體，它以簡單、快速和經(jīng)濟(jì)的方式生長，可高效、快速地獲取高純度人 β2 微球蛋白。同時，因為親和標(biāo)記在重組表達(dá)中的應(yīng)用也越來越廣泛，His 和 MBP 標(biāo)記蛋白的純化和檢測能有效地分離所需的蛋白質(zhì)，最終獲得完整的、具有生物活性的β2 微球蛋白，并且大部分產(chǎn)物以可溶形式存在。重組完整β2 微球蛋白經(jīng)純化后，濃度為 185 mg/L。儲存 64 周后，分別檢測不同溫度和不同時間點儲存的β2 微球蛋白的濃度，證明β2 微球蛋白在一段較長的儲存期內(nèi)均能保持其最初的濃度和功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料JM109 菌株及BL21(DE3) 均購自 Takara 公司；質(zhì)粒 pRSF-Duet 為作者實驗室保存。

1.1.2 試劑 核酸內(nèi)切酶I、HI和RI、T4 連接酶購自 NEB 公司；TEV 酶為實驗室自制；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均購自 Axygen Scientific 公司；LB 培養(yǎng)基、TB 培養(yǎng)基、卡那抗生素、IPTG、聚丙烯酰胺、Tris-HCl、NaCl、咪唑均為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 37 ℃恒溫?fù)u床購自蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；DNA 電泳儀和蛋白電泳儀購自 Bio-Rad 公司；Ni-NTA 鎳離子親和樹脂及鎳離子親和層析柱購自上海生工生物工程股份有限公司；超聲細(xì)胞粉碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；7100 生化儀購自日本日立公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 TB 培養(yǎng)液：酪蛋白水解物 12 g/L，酵母提取物 24 g/L，磷酸氫二鉀 9.4 g/L，磷酸二氫鉀2.2 g/L；固體 TB 培養(yǎng)基額外加入瓊脂15 g/L。以上培養(yǎng)基均加入 100 μg/ml 卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 密碼子優(yōu)化與新基因合成 從 NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索β2 微球蛋白基因轉(zhuǎn)錄本 1 的 CDS 序列，替換稀有密碼子，在其 N 端增加HI酶切位點和 TEV 蛋白酶酶切位點，C 端增加RI酶切位點，將完成改造的基因序列委托北京金唯智公司合成。

1.2.2 高效表達(dá)菌株的構(gòu)建 將 MBP 蛋白序列的I和HI雙酶切片段插入pRSF-Duet 載體，再將合成的 β2-MG 的HI和R I雙酶切片段插入到 MBP 序列 C 端，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109 菌株（Kan+），對陽性單克隆進(jìn)行篩選，得到 pMBP-β2-MG pRSF 質(zhì)粒，測序鑒定序列。

1.2.3 重組 MBP-β2-MG pRSF 的表達(dá)與純化 將構(gòu)建好的 pMBP-β2-MG pRSF 轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，挑取單菌落于 5 ml LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。以 1:500 比例將菌液轉(zhuǎn)接至 500 ml TB 培養(yǎng)基，恒溫在 37 ℃，230 r/min 培養(yǎng)至600= 0.4 ~ 0.6，向培養(yǎng)基中加入終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 16 h。取 500 ml 培養(yǎng)液 3000 r/min 離心分離 10 min 后收集菌體，菌體重懸于 30 ml 蛋白提取緩沖液中（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑），在冰浴條件下，使用超聲細(xì)胞粉碎儀超聲 15 min 破碎菌體，裂解物 12 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清液與 Ni-NTA 冰上孵育 1 h，用 250 mmol/L的咪唑洗脫重組 MBP-β2-MG pRSF 蛋白。純化的重組 MBP-β2-MG 蛋白用 TEV 酶切處理，去除多余的蛋白標(biāo)簽。再次將酶切體系與鎳離子親和樹脂（Ni-NTA）4 ℃結(jié)合 1 h，收集流出液，即β2 微球蛋白。

1.2.4 β2 微球蛋白濃度檢測及存儲穩(wěn)定性檢測 使用生化儀檢測 MBP-β2-MG 蛋白濃度。將純化的β2 微球蛋白分別于 4 ℃和–20 ℃分裝保存，于 1、2、4、8、16、32、64 周后取樣測定蛋白濃度。

在檢核思考時，教師也要提醒學(xué)生注意方法的可行性，有的實驗方案不能隨意調(diào)整。例如，在“探究pH對過氧化氫酶的影響”實驗中，教師可以引導(dǎo)學(xué)生思考能否探究pH對其他酶的影響，如唾液淀粉酶等，讓學(xué)生選擇相應(yīng)的檢測指標(biāo)并設(shè)計實驗方案。學(xué)生根據(jù)所學(xué)過的知識可能會想到用本尼迪特試劑來檢測淀粉水解的產(chǎn)物還原糖，或用碘-碘化鉀溶液來檢測淀粉剩余的量。從理論上看似乎是可行的，但是實際操作起來卻發(fā)現(xiàn)存在問題。因為碘-碘化鉀溶液在堿性環(huán)境下不能起作用，本尼迪特試劑本身也會受到酸性環(huán)境的影響。這樣的拓展實驗嘗試可以幫助學(xué)生理解為何教材中選用過氧化氫酶，而不選用唾液淀粉酶來進(jìn)行這項實驗。

1.2.5 β2 微球蛋白純品與校準(zhǔn)品的互通性分析 收集 β2 微球蛋白純品與 β2 微球蛋白校準(zhǔn)品（RANDOX，BM1362），用不同濃度的血清稀釋。采用 β2 微球蛋白試劑盒測定其濃度，測量值進(jìn)行回歸曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 β2 微球蛋白基因密碼子優(yōu)化

β2 微球蛋白基因含有 99 個氨基酸，其中17 個氨基酸（17%）由大腸桿菌中罕見的密碼子編碼。其中，AGA、GGA 和 CCC 密碼子可能與大腸桿菌異源蛋白表達(dá)的有害作用有關(guān)。另外，AGA 被認(rèn)為是大腸桿菌中使用最少的密碼子，將導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的顯著降低（表 1）。為了盡量減少罕見的密碼子對大腸桿菌中 β2 微球蛋白基因表達(dá)的潛在不利影響，罕見密碼子被常用密碼子替代（http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/ usage.htm），并根據(jù)新的序列合成 β2微球蛋白基因。

2.2 高效表達(dá)載體的獲得

圖 1A 為所用 pMBP-β2-MG pRSF 載體結(jié)構(gòu)圖。β2-MG 基因由 T7 啟動子控制，在 N 端加入 MBP 標(biāo)記，以促進(jìn)靶蛋白的純化。經(jīng)抗生素篩選的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，獲得大小約 300 bp 的片段，與預(yù)期 β2-MG 片段大小一致（圖 1B），送質(zhì)粒測序，經(jīng)過 VectorNTI 軟件對比，質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期的質(zhì)粒圖譜完全一致，表明 pMBP-β2-MG pRSF 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 pMBP-β2-MG pRSF 的表達(dá)分析

將所構(gòu)建的表達(dá)載體pMBP-β2-MG pRSF 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)。經(jīng) TB 培養(yǎng)基培養(yǎng)及 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，將菌體離心、破碎，上清與鎳柱親和層析，咪唑洗脫的蛋白液經(jīng) SDS-PAGE 電泳。如圖 2 所示，在BL21 中可見約 55 kD 電泳條帶，大小與預(yù)期的 MBP-β2-MG 融合蛋白相符，純度達(dá)到 95% 以上，表明MBP-β2-MG 融合蛋白已成功表達(dá)。用自制的 TEV 蛋白酶對 MBP 的切除效率很高，MBP 切除比較完全。

表 1 β2 微球蛋白基因罕見密碼子和優(yōu)化密碼子的比較

圖 1 構(gòu)建和驗證重組表達(dá)載體 pMBP-β2-MG pRSF（A：pMBP-β2-MG pRSF 載體結(jié)構(gòu)圖；B：pMBP-β2-MG pRSF 經(jīng)過BamH I 和EcoR I 酶切后的瓊脂糖電泳結(jié)果；1：pMBP-β2-MG pRSF 經(jīng)過BamHI 和EcoR I 酶切結(jié)果；M：DNA marker）

Figure 1 Construction and verification of the recombinant expression plasmid pMBP-β2-MG pRSF (A: Schematic diagram of the recombinant expression plasmid pMBP-β2-MG pRSF; B: Agarose electrophoresis of pMBP-β2-MG pRSF digested byHI andRI;1: pMBP-β2-MG pRSF digested byHI andR I; M: DNA marker)

M：Marker；1：純化的 MBP-β2-MG 蛋白；2：MBP-β2-MG 蛋白以 MBP-TEV蛋白酶消化，MBP 與 β2-MG 蛋白分離；3：MBP-TEV 蛋白

Figure 2 SDS-PAGE analysis of purified MBP-β2-MG protein

為了進(jìn)一步證實 β2-MG 表達(dá)的正確性，切割 β2-MG 蛋白條帶，經(jīng)胰蛋白酶酶切后進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到靶蛋白的氨基酸序列信息（圖 3A）。肽段檢測結(jié)果如圖 3B 所示，得分最高的三個蛋白都為 β2 微球蛋白，且有 8 個肽段都與 β2 微球蛋白的氨基酸序列吻合，結(jié)果表明表達(dá)蛋白的確為 β2-MG。

2.4 β2 微球蛋白濃度測定及穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)的功能與其蛋白濃度密切相關(guān)，以 Bradford 蛋白檢測法進(jìn)一步檢測了 β2 微球蛋白的濃度。MBP-β2-MG 融合蛋白經(jīng)生化儀測定濃度為 100 mg/L，用 TEV 蛋白酶切除 MBP、組氨酸標(biāo)簽，剩余的 β2 微球蛋白純品濃度可達(dá)185 mg/L。純化蛋白通常需要保存很長一段時間，儲存“保質(zhì)期”取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和儲存條件。為了研究在 4 ℃和–20 ℃下，50% 甘油溶液中保存的β2 微球蛋白的穩(wěn)定性，分別測定了不同時間點（0、1、2、4、8、16、32 和 64 周）的蛋白濃度。如圖 4 所示，β2 微球蛋白在 4 ℃和–20 ℃保存條件下均很穩(wěn)定，半衰期較長，64 周后 4 ℃條件下濃度水平下降不到 7%，–20 ℃條件下濃度水平下降不到 5%。結(jié)果表明，重組β2 微球蛋白的穩(wěn)定性良好，適合低溫長時間保存。

圖 3 質(zhì)譜鑒定蛋白序列（A：與 β2 微球蛋白匹配的肽段，匹配可信度綠色> 黃色> 紅色；B：匹配蛋白具體信息）

Figure 3 Identification of protein sequence by mass spectrometry (A: Peptides that match β2 microglobulin. Match credibility: green > yellow > red; B: Detail information of matching proteins)

圖4 β2 微球蛋白穩(wěn)定性分析

Figure 4 Stability analysis of β2 microglobulin

2.5 β2 微球蛋白純品與校準(zhǔn)品的互通性分析

分別測定血清稀釋后的不同濃度 β2 微球蛋白純品與英國 RANDOX 生化校準(zhǔn)品，然后進(jìn)行線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)為 0.9995（圖 5）。證明本研究獲得的 β2 微球蛋白純品與 RANDOX 生化校準(zhǔn)品互通性良好。

圖 5 β2 微球蛋白與 RANDOX 校準(zhǔn)品的互通性分析

Figure 5 Commutability between the purified β2 microglobulin and the β2 microglobulin from RANDOX

3 討論

近年 β2 微球蛋白作為免疫性疾病標(biāo)志物和腫瘤標(biāo)志物在臨床檢驗中廣泛應(yīng)用。隨著對其研究的深入，β2 微球蛋白還參與形成主要組織相容性復(fù)合體（MHC I或 MHC II）或類似的異二聚體[4]。獲取 β2 微球蛋白純品不僅可以制備相關(guān)質(zhì)控品，也為 β2 微球蛋白的臨床和實驗室研究奠定基礎(chǔ)。因為編碼氨基酸的密碼子具有簡并性，而每種生物對同義密碼子的選擇都有自己偏好性[6]。大腸桿菌作為一個原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)常被用來表達(dá)外源蛋白。而密碼子使用的物種特異性變異與大腸桿菌中的基因表達(dá)水平密切相關(guān)。β2 微球蛋白cDNAs 中有許多密碼子在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中不屬于大腸桿菌偏好密碼子。稀有密碼子的存在，可以降低翻譯率，導(dǎo)致翻譯錯誤。因此，為實現(xiàn) β2 微球蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，進(jìn)一步利用密碼子優(yōu)化技術(shù)，合成了 β2 微球蛋白全長密碼子優(yōu)化基因，以克服這一問題。而不經(jīng)過密碼子優(yōu)化的 β2 微球蛋白野生型編碼序列，經(jīng)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)未誘導(dǎo)出任何可見條帶。

雖然真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白具有天然構(gòu)象，同時具有蛋白活性高的特點，但也存在表達(dá)量低，需要耗費大量時間和精力的缺點。談春榮等[7]利用酵母系統(tǒng)表達(dá) β2 微球蛋白，雖能克服胞外水解酶的問題，但蛋白濃度只可達(dá)到 73 mg/L。原核表達(dá)系統(tǒng)作為目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達(dá)體系，優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。本室采用原核系統(tǒng)表達(dá) β2 微球蛋白，在融合蛋白N 端提供 6-His 標(biāo)簽，His 標(biāo)記促進(jìn)了融合蛋白的純化。在 IPTG 作用下表達(dá) 6His-融合蛋白后，25% 以上的大腸桿菌表達(dá)蛋白都為MBP-β2-MG 融合蛋白。本研究還采用 β2 微球蛋白與助溶蛋白 MBP 共表達(dá)的方式，克服了常見的包涵體問題。同時調(diào)整培養(yǎng)基配方以及通過實驗室自制的 TEV 蛋白酶切除 MBP，使 β2 微球蛋白 N 端充分暴露，β2 微球蛋白濃度由 28 mg/L 提高至 185 mg/L，大大提高了 β2 微球蛋白的表達(dá)效率和產(chǎn)量。

近年來，臨床實驗室中用于質(zhì)量控制的參考物質(zhì)通常來源于人、豬或其他動物的血清樣品，這一過程既昂貴又復(fù)雜，并且使用人血清有傳播傳染病的潛在風(fēng)險[8]。采取大腸桿菌這一簡單高效的表達(dá)系統(tǒng)，不僅獲得大量高濃度、高穩(wěn)定性以及與國際通用校準(zhǔn)品互通性良好的β2 微球蛋白，并以較低的成本大大提高其在臨床生化實驗室中的應(yīng)用。該重組β2 微球蛋白有望成為臨床實驗室常規(guī)β2 微球蛋白檢測的質(zhì)控品。

志謝 特別感謝中國科學(xué)院動物研究所膜生物學(xué)國家重點實驗室公共儀器平臺對 β2 微球蛋白質(zhì)譜鑒定工作的大力支持和幫助！

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An efficient method for the preparation of human β2-microglobulin reference material and its application prospects

ZOU Li-hui, WANG Meng, HUANG Wei, ZHANG En-yi, XIAO Fei, WANG Yu-mei

The MOH Key Laboratory of Geriatrics (ZOU Li-hui, HUANG Wei, ZHANG En-yi, XIAO Fei), Department of Laboratory Medicine (WANG Meng), Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Beijing 100730, China; Department of Biomaterials, National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (WANG Yu-mei)

To construct optimized human β2-microglobulin prokaryotic expression system, and obtain recombinant β2-microglobulin efficiently and rapidly which is expected to provide basis for the preparation of reference materials and application in quality control in clinical laboratories.

The optimized human β2-microglobulin gene was synthesized and cloned into pRSF-Duet vector with maltose binding protein (MBP) to generate MBP-β2-MG pRSF expression vector. Recombinant human β2-MG protein was expressed inBL21(DE3) and its concentration was analyzed by Hitachi analysis system after MBP was cut by TEV protease. The stability of β2-MG proteinwas detected during long-term storage at 4 ℃ and –20 ℃. The compatibility of the purified β2 microglobulin and the β2 microglobulin from RANDOX was analyzed.

The prokaryotic expression vector MBP-β2-MG pRSF was successfully constructed. When expressed inBL21(DE3), the concentration of soluble MBP-β2-MG was about 100 mg/L, and the concentration of β2-MG protein could reach 185 mg/L. β2-MG proteinwas stable after 64 weeks at 4 ℃ and –20 ℃. The purified β2 microglobulin had good compatibility with the β2 microglobulin from RANDOX.

The recombinant MBP- β2-MG protein is soluble and the concentration of β2-MG can reach 185 mg/L, which can fully meet the requirement of the preparation of diagnostic reagent.

Beat2-microglobulin; Recombinant proteins; Reference material

WANG Yu-mei, Email: wangyumei@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.004

北京市自然科學(xué)基金（7172193）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2017ZX09304026）；國家自然科學(xué)基金（81571384）

王玉梅，Email：wangyumei@nifdc.org.cn

2018-05-16