魏東，李天柱，陳成，尤明強，王國治

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布氏菌疫苗效力評價小鼠模型的建立

魏東，李天柱，陳成，尤明強，王國治

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室/衛(wèi)生部生物技術檢定方法及其標準化重點實驗室（魏東、陳成、王國治）；730046 蘭州生物制品研究所有限責任公司菌苗室二室（李天柱、尤明強）

建立布氏菌疫苗效力評價小鼠模型，為布氏菌疫苗有效性評價奠定基礎。

測定感染布氏菌株動物的脾臟細菌數(shù)，比較菌株毒力，篩選出布氏菌疫苗效力評價用布氏菌株。通過最小感染劑量的測定為效力評價的感染劑量提供基礎數(shù)據(jù)。檢測動物體內布氏菌增殖情況，確定動物解剖時間。將不同劑量的布氏菌活疫苗免疫小鼠，4 周后用布氏菌強毒菌株皮下感染，感染 4 周后將動物解剖測定脾臟細菌數(shù)，分析疫苗保護效果。

篩選出布氏菌疫苗效力評價感染用布氏菌株，該菌株的皮下最小感染劑量為 300 CFU，感染后 4 周動物脾臟細菌數(shù)達到較高且穩(wěn)定水平。布氏菌活疫苗免疫小鼠后能產生較好的保護效果，免疫劑量與保護力水平之間有較好的量效關系。

建立了布氏菌疫苗效力評價小鼠模型，為新型布氏菌疫苗的研制奠定了基礎。

布魯桿菌菌苗； 最小感染量； 效力

布魯氏菌?。ê喎Q布病）是由布魯氏菌（簡稱布氏菌）屬引起的一類人畜共患疾病，是《中華人民共和國傳染病防治法》中規(guī)定報告的乙類傳染病。布病在世界范圍內廣泛流行，是全球特別是發(fā)展中國家面臨的主要公共衛(wèi)生問題[1-2]。20 世紀末以來，人布病在世界范圍內的發(fā)病率呈上升態(tài)勢，每年新發(fā)病例數(shù)超過 50 萬例，已成為重要的國際性公共衛(wèi)生問題[3]。中國是布病的歷史疫區(qū)，近年來布病流行較為嚴重，且發(fā)病率逐年遞增，2017 年發(fā)病率為 2.79/10 萬，已經連續(xù) 9 年發(fā)病人數(shù)超過 3 萬。

目前，接種疫苗是世界公認的能夠降低布病發(fā)生和傳播最有效的、最經濟的方法[4-5]。我國現(xiàn)人用布氏菌活疫苗采用皮上劃痕接種[6]，該方法操作復雜，不能準確定量。改進疫苗的免疫途徑是布氏菌疫苗研究的熱點，而有效性評價是新疫苗研發(fā)的重要內容。為此，本研究建立了布氏菌疫苗效力評價小鼠模型，為布氏菌疫苗有效性評價奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物 SPF 級 BALB/c 小鼠，18 ~ 22 g，雌性，由中國食品藥品檢定研究院（中檢院）實驗動物中心提供，飼養(yǎng)在復旦大學上海醫(yī)學院生物安全三級實驗室。

1.1.2 菌種 羊種布氏菌菌株編號分別為：CMCC55313（GH12）、CMCC55314（GH18）、CMCC55315（GH21）、CMCC55316（GH23）、CMCC55317（GH24）、CMCC55318（XJ91-60）、CMCC55210（16M），均由中檢院結核病疫苗室提供。

1.1.3 疫苗 布氏菌活疫苗（104M株）由中檢院結核病疫苗室制備。

1.1.4 試劑和儀器 胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基購自美國 BD 公司；生物安全柜為美國 NuAire LabGard 公司產品；恒溫培養(yǎng)箱為美國 NuAire IR Autoflow 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 布氏菌毒力比較 分別用 7 株羊種布氏菌感染小鼠，每株菌感染 5 只小鼠，感染用菌液濃度均為 5.0 × 105CFU/ml，每只小鼠后肢皮下注射 0.2 ml 菌液，感染后 2 周解剖，無菌取動物脾臟，通過脾臟活菌數(shù)分析，比較各菌株的毒力，篩選出毒力最強的菌株。

1.2.2 最小感染量的測定 將 18 只BALB/c 小鼠隨機分成 6 組，每組 3 只動物，后肢皮下感染不同劑量的羊種布氏菌 XJ91-60 株，感染劑量分別為1 × 101CFU/只、3 × 101CFU/只、1 ×102CFU/只、3 × 102CFU/只、1 × 103CFU/只、3 × 103CFU/只，感染后 4 周，將小鼠解剖，無菌取脾，測定脾臟細菌數(shù)，組內全部動物出現(xiàn)脾臟感染的最小感染劑量即為最小感染量（minimum infection dose，MID）。

1.2.3 感染動物解剖時間的確定 將羊種布氏菌 XJ91-60 株后肢皮下感染15 只BALB/c 小鼠，感染用菌液濃度為 5.0 × 105CFU/ml，每只小鼠注射 0.2 ml，分別在感染后 2 周、4 周、12 周各解剖5 只動物，通過脾臟活菌數(shù)分析，研究布氏菌在感染動物體內的增殖情況，為解剖時間的確定提供依據(jù)。

1.2.4 布氏菌疫苗效力評價研究 將25 只BALB/c 小鼠隨機分成 5 組，每組 5 只，免疫組 1（1 × 104/只）、免疫組 2（1 × 105/只）、免疫組 3（1 × 106/只）、免疫組 4（1 × 107/只）、生理鹽水對照組，注射途徑為后肢皮內。免疫后 4 周，經皮下感染羊種布氏菌 XJ91-60 株1000 個 MID（3 × 105CFU）。感染后4 周將動物解剖，無菌取脾，測定脾臟感染菌的活菌數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 Minitab 16 統(tǒng)計軟件，將脾臟活菌數(shù)取以 10 為底的對數(shù)后進行檢驗，如脾臟無細菌生長，按活菌數(shù)為 1 進行統(tǒng)計分析，結果以< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 布氏菌株毒力比較

7 株羊種布氏菌株皮下感染小鼠后，通過脾臟活菌數(shù)分析，毒力最強的菌株為 XJ91-60 株，以該菌株作為效力評價感染用菌，結果見表 1。

2.2 最小感染量的測定

小鼠經皮下分別感染系列濃度的羊種布氏菌XJ91-60 株，感染 4 周后的脾臟活菌數(shù)測定結果見表 2。感染劑量為 3 × 101CFU 時，即可出現(xiàn)動物的脾臟感染；感染劑量為 3 × 102CFU 時，組內全部動物出現(xiàn)脾臟感染。因此，羊種布氏菌 XJ 91-60 株的小鼠皮下最小感染量為 3 × 102CFU。

表 1 布氏菌感染動物脾臟活菌數(shù)測定結果

2.3 感染動物解剖時間的確定

將羊種布氏菌 XJ91-60 株感染小鼠，各檢測時間點脾臟感染率均為 100%，感染后 2 周脾菌數(shù)的對數(shù)值為 3.53 ± 0.34，感染后 4 周脾菌數(shù)的對數(shù)值為 5.50 ± 1.19，感染后 12 周脾菌數(shù)的對數(shù)值為 5.83 ± 1.10，感染后 4 周脾菌數(shù)達到較高且穩(wěn)定水平，感染后 4 周與感染后 12 周脾菌數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（= 0.44，> 0.05），結果見圖 1。

2.4 布氏菌疫苗效力評價研究

小鼠經不同劑量布氏菌疫苗免疫后 4 周用羊種布氏菌 XJ91-60 株進行皮下感染，感染后 4 周脾臟細菌分離情況見圖 2。其中，生理鹽水對照組動物的脾臟細菌分離數(shù)的對數(shù)值為 5.29 ± 0.34，免疫組 1（1 × 104/只）的脾臟細菌分離數(shù)的對數(shù)值為 2.85 ± 0.56，免疫組 2（1 × 105/只）的脾臟細菌分離數(shù)的對數(shù)值為 0.47 ± 0.94，免疫組 3（1 ×106/只）及免疫組 4（1 × 107/只）均未分離到感染菌。免疫組 1 及免疫組 2 的脾臟細菌分離數(shù)均低于生理鹽水對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（= 7.42，< 0.01；= 9.95，< 0.01）。免疫組 1 的脾臟細菌分離數(shù)高于免疫組 2，差異具有統(tǒng)計學意義（= 4.33，< 0.01）。免疫劑量與脾菌數(shù)的相關性系數(shù)為–0.963，呈強相關。該結果表明，布氏菌疫苗能對小鼠提供較好的保護效果，該評價模型可用于布氏菌疫苗的效力評價研究。

表 2 最小感染量測定結果

圖 1 感染動物體內布氏菌XJ91-60 株增殖結果

Figure 1 Results of proliferation ofXJ91-60 strainin infected animals

3 討論

布病不僅影響畜牧業(yè)和相關產業(yè)的發(fā)展，造成社會經濟損失，并且對人類的健康構成重大威脅[7]，美國疾病預防控制中心將布氏菌列為潛在的生物恐怖戰(zhàn)劑[8-9]。鑒于布病造成的嚴重損失，世界上許多國家和地區(qū)制定了相應的防控和根除計劃，研制新型疫苗在此過程中具有重要意義。動物模型上的有效性評價是新疫苗研制過程中一項重要研究內容。

疫苗效力評價的動物感染模型研究需要確定敏感模型動物，挑選毒力最強的菌株用于動物感染，確定菌株的最小感染劑量，通過檢測脾臟感染細菌達到較高且穩(wěn)定水平的時間來確定感染動物的解剖時機，并通過參考疫苗考核效力評價體系的適用性。

小鼠和豚鼠都是布氏菌的易感動物，由于小鼠便于操作，它是國內外布氏菌疫苗研究常用的動物模型[10]。布氏菌屬經典分類為 6 個種：羊種布氏菌（）、牛種布氏菌（）、豬種布氏菌（）、犬種布氏菌（）、綿羊附睪布氏菌（）以及沙林鼠種布氏菌（），其中對人致病的主要是牛種、羊種和豬種布氏菌[11]。當前，從我國布病患者分離的感染菌主要是羊種布氏菌[12-13]。所以，本研究從羊種布氏菌株中篩選效力評價感染用細菌[14]，經比較，毒力最強的菌株為 XJ91-60 株。將不同劑量布氏菌 XJ91-60 株感染小鼠，感染劑量為 3 ×101CFU 時即可出現(xiàn)動物感染，小鼠皮下注射的最小感染量為 3 × 102CFU，說明該菌株毒力較強。布氏菌 XJ91-60 株皮下感染小鼠 1 個月后，脾臟細菌分離數(shù)達到較高且穩(wěn)定水平，所以確定感染動物的解剖時間為感染后 1 個月。以布氏菌活疫苗為參考疫苗考核該效力評價體系，設置了 4 個免疫劑量，免疫后小鼠皮下感染1000 個 MID 羊種布氏菌 XJ91-60 株，對照組動物均能夠分離到大量感染菌，疫苗免疫小鼠能有效抵抗布氏菌強毒株的感染，具有較好的保護效果，隨免疫劑量增加脾臟細菌分離數(shù)明顯降低，免疫劑量與保護力水平之間有較好的量效關系。本研究建立了布氏菌疫苗效力評價的小鼠模型，為新型布氏菌疫苗有效性評價奠定了基礎。

圖 2 布氏菌疫苗效力評價結果

Figure 2 Results of efficacy evaluation of brucellosis vaccine

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Establishment of the brucellosis vaccine potency evaluation model in mice

WEI Dong, LI Tian-zhu, CHEN Cheng,YOU Ming-qiang, WANG Guo-zhi

TB Vaccine Division, National Institute for Food and Drug Control, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, Beijing 100050, China (WEI Dong, CHEN Cheng, WANG Guo-zhi); Second Bacterial Vaccine Division, Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., Lanzhou 730046, China (LI Tian-zhu, YOU Ming-qiang)

To develop and utilize appropriate animal model ofinfection in order to evaluate the efficacy of vaccines for human brucellosis.

The most virulentstrain was selected by comparing the virulence. In order to establish the minimum infection dose of the selectedstrain in BALB/c mice, groups of 6 animals were injected with series concentration ofbacteria. In order to determine the time of anatomy, mice were culled and the bacterial loads in the spleens were determined at different time after injection. Two experiments were performed to confirm and further characterize this mouse model. The mice were challenged withbacteria at 4 weeks after immunization, and the bacterial loads in the spleens were determined at 4 weeks after injection.

Thestrain used for the evaluation of efficacy of brucellosis vaccine was selected, and the minimum infection dose of the selectedXJ91-60 strain in BALB/c mice was 300 CFU. Bacterial loads in the spleen achieved high and stable level at 4 weeks after injection. The mice immunized with brucellosis vaccinewere protected against challenge with virulentstrain.

Brucellosis vaccine potency evaluation model in mice is established, which lays a foundation for the development of the newbrucellosis vaccine.

Brucella vaccine; Minimum infection dose; Potency

WANG Guo-zhi, Email: vaccine2012@126.com

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2014ZX09304311-002）

王國治，Email：vaccine2012@126.com

2018-06-26

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.005