侯 辰，唐 鵬，劉 玥，張 欣，陳 麗，張李娜

腦缺血再灌注(IR)損傷是一種嚴(yán)重的臨床問(wèn)題，其原因包括心臟驟停、周?chē)芄δ懿蝗妥渲衃1]。損傷機(jī)制在缺血期間被觸發(fā)，在再灌注期間加重[2]。IR的損傷機(jī)制包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和線粒體功能損傷[3]。在缺血過(guò)程中，細(xì)胞膜改變導(dǎo)致鈣超載，從而激活細(xì)胞內(nèi)鈣依賴的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，抑制抗炎細(xì)胞因子，并且促進(jìn)次黃嘌呤和自由基的產(chǎn)生。在再灌注后期，過(guò)量的氧與次黃嘌呤發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致多種有毒過(guò)氧化物的形成。這些強(qiáng)效氧化劑會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，以及蛋白質(zhì)氧化，并通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化直接損傷細(xì)胞膜[4]。因此IR損傷過(guò)程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)是最重要的病理過(guò)程[5]。羽扇豆醇是一種三萜類(lèi)天然產(chǎn)物，幾種常見(jiàn)的果蔬中都含有羽扇豆醇，如草莓、卷心菜、芒果、葡萄、青椒和橄欖等[6]。研究表明，羽扇豆醇對(duì)炎癥、癌癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、心臟病、腎毒性和肝毒性都有改善的作用[7]。本研究旨在探討羽扇豆醇對(duì)IR大鼠氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 120只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250～280 g。動(dòng)物被安置在特定的無(wú)菌環(huán)境中：溫度22℃左右，相對(duì)濕度55%～60%，12 h晝夜交替，大鼠能自由獲取食物和飲用水。Tunel試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit)購(gòu)自羅氏(Roche)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自R&D公司?？笲cl-2(ab196495)和Bax(ab32503)抗體購(gòu)自Abcam公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自Solarbio公司，貨號(hào)：G1120。

1.2動(dòng)物分組及模型制備 120只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、不同濃度羽扇豆醇組。模型組和不同濃度組采用改良線栓法制備大鼠IR損傷模型：用2%異氟醚麻醉大鼠，用尼龍線結(jié)扎大鼠頸總動(dòng)脈，線栓向上推行至大腦中動(dòng)脈，造成大腦中動(dòng)脈梗阻，缺血2 h后，拔退線栓，恢復(fù)大腦供血，縫合消毒，待大鼠醒后，按Longa標(biāo)準(zhǔn)篩選IR模型[8]，符合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的模型進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組：大鼠麻醉后進(jìn)行開(kāi)刀和縫合手術(shù)，不進(jìn)行動(dòng)脈結(jié)扎。不同濃度羽扇豆醇組分別給予羽扇豆醇10、20、50 mg/kg腹腔注射，模型組和假手術(shù)組均給予相同濃度的DMSO生理鹽水腹腔注射。

1.3標(biāo)本采集 5組大鼠連續(xù)注射1周藥物或溶劑后收集血清待測(cè)，頸椎脫臼法處死，取腦組織制成石蠟切片(固定-脫水-包埋-切片)用于后續(xù)切片染色；并收集各組腦組織液氮冷凍，-80℃冰箱冷藏待檢測(cè)。

1.4HE染色 將5組大鼠腦組織石蠟切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；給予HE染色，在顯微鏡下觀察組織病變情況并拍照。

1.5TUNEL染色 二甲苯脫蠟，每次5 min；梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)復(fù)水，每次3 min；在25℃條件下，Proteinase K工作液消化組織15 min；PBS漂洗；按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL染色，漂洗；玻片干后加50 μl converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃條件下反應(yīng)30 min，漂洗；在組織處加50 μl DAB底物，在25℃條件下反應(yīng)10 min，漂洗；拍照，然后用蘇木素復(fù)染3～5 s，立即用自來(lái)水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。加一滴PBS在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞并拍照。

1.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)腦組織線粒體損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)水平 液氮研磨腦組織，提取組織中總蛋白；取等量蛋白與適量Loading buffer混合，100℃金屬浴10 min；上樣到SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；加入抗Bax和抗Bcl-2一抗，4℃過(guò)夜孵育，次日，TBST清洗后再加標(biāo)記HRP的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH作為上樣量一致的參照，至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.7ELISA檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平和血清炎性因子水平 取5組大鼠血清，檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)水平和白介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF-α)水平。按照說(shuō)明書(shū)，加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl于反應(yīng)孔，加入待測(cè)樣品50 μl于反應(yīng)孔內(nèi)，設(shè)計(jì)好復(fù)孔和陰性對(duì)照；立即加入50 μl的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h；甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作4次；每孔加入80 μl的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min，洗滌方法同上；每孔加入底物A、B各50 μl，輕輕振蕩混勻，37℃避光溫育10 min；取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μl終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果：在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(OD)值。

2 結(jié)果

2.1IR損傷改善情況 模型組相較于假手術(shù)組病理改變非常明顯，提示大鼠模型制備成功；與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組腦組織損傷程度隨加藥濃度增加而明顯減輕，腦組織間隙的空泡變少，并且出現(xiàn)核邊集、固縮的神經(jīng)元也明顯減少。見(jiàn)圖1。

2.2腦組織細(xì)胞凋亡率 與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞形態(tài)特征呈現(xiàn)出未染色細(xì)胞變小，胞膜完整，出現(xiàn)空泡；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀；不同濃度羽扇豆醇組細(xì)胞形態(tài)隨藥物濃度增加逐漸趨近于假手術(shù)組。見(jiàn)圖2。假手術(shù)組、模型組、羽扇豆醇10 mg/kg組、羽扇豆醇20 mg/kg組和羽扇豆醇50 mg/kg組細(xì)胞凋亡率分別為(5.1±0.5)%、(58.2±8.1)%、(39.3±8.9)%、(24.2±7.1)%、(13.3±5.2)%。模型組細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組(P<0.01)；不同濃度羽扇豆醇組細(xì)胞凋亡率低于模型組，且呈劑量依賴性(P<0.01)。

圖1 5組大鼠腦組織病理變化情況(HE×400)

圖2 5組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況(TUNNEL×400)

2.3線粒體損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.01)。與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 5組大鼠腦組織線粒體損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)水平

組別鼠數(shù)Bcl-2Bax假手術(shù)組241.40±0.100.12±0.05模型組240.15±0.01b1.60±0.13b羽扇豆醇10 mg/kg組240.30±0.06d1.20±0.14d羽扇豆醇20 mg/kg組240.64±0.07df0.40±0.07df羽扇豆醇50 mg/kg組241.15±0.10dfh0.20±0.05dfh

注：與假手術(shù)組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與羽扇豆醇10 mg/kg組比較，fP<0.01；與羽扇豆醇20 mg/kg組比較，hP<0.01

2.4氧化應(yīng)激損傷情況 與假手術(shù)組比較，模型組血清中SOD和GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.01)。與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組血清中SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平變化情況

注：與假手術(shù)組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與羽扇豆醇10 mg/kg組比較，fP<0.01；與羽扇豆醇20 mg/kg組比較，hP<0.01

2.5炎性反應(yīng) 與假手術(shù)組比較，模型組IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 5組大鼠血清炎性因子水平變化情況

注：與假手術(shù)組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與羽扇豆醇10 mg/kg組比較，fP<0.01；與羽扇豆醇20 mg/kg組比較，hP<0.01

3 討論

IR損傷過(guò)程中常伴隨缺血腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，這是通過(guò)激活caspase依賴性凋亡信號(hào)通路介導(dǎo)的[3，9]。Bax加速細(xì)胞凋亡過(guò)程，而B(niǎo)cl-2抑制細(xì)胞凋亡。Bax/Bcl-2平衡失調(diào)會(huì)造成線粒體損傷[10]。在缺血區(qū)域，Bax水平升高，而B(niǎo)cl-2水平下降，導(dǎo)致線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，從而引發(fā)腦缺血后細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，且Bax水平升高，Bcl-2水平下降，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。用不同濃度羽扇豆醇處理后，Bax水平隨藥物濃度增加而降低，Bcl-2水平隨藥物濃度增加而升高。提示羽扇豆醇能降低大鼠IR損傷模型細(xì)胞凋亡，減少線粒體損傷。

有大量的證據(jù)證明氧化應(yīng)激在缺血再灌注誘導(dǎo)的大腦氧化應(yīng)激的發(fā)病機(jī)制中的作用[5,12]。活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化物在氧化應(yīng)激損傷中起關(guān)鍵作用[13-14]。機(jī)體在對(duì)抗氧化應(yīng)激時(shí)，SOD、GSH能抵消部分過(guò)氧化物，局部缺血時(shí)，這些物質(zhì)幾乎消耗殆盡；而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平則大幅提高。羽扇豆醇的抗氧化應(yīng)激能力早有報(bào)道。Sunitha等[15]發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇通過(guò)清除自由基提高大鼠肝臟的抗氧化作用，從而改變鎘暴露誘導(dǎo)的組織氧化還原系統(tǒng)的影響。Prasad等[16]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充羽扇豆醇可以有效地降低肝臟二甲丁醇酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，恢復(fù)抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化作用。Yamashita等[17]研究表明，Lupeol能抑制fMLP處理的人中性粒細(xì)胞中花生四烯酸誘導(dǎo)的過(guò)氧化物。Lupeol已被證明可以抑制活性氧生成，并能恢復(fù)在雄激素預(yù)處理小鼠的前列腺組織中衰竭的抗氧化水平[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組SOD和GSH水平低于假手術(shù)組，MDA水平高于假手術(shù)組；用不同濃度羽扇豆醇處理后，血清SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，與上述研究結(jié)果一致。提示羽扇豆醇能增加抗氧化物酶活性，有效減少氧化應(yīng)激損傷。

近年來(lái)，大量研究表明炎性反應(yīng)在IR損傷中起著關(guān)鍵作用[19-20]。大量炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)參與IR損傷后的腦細(xì)胞凋亡和壞死[21]，及腦缺血引起的炎性反應(yīng)[22]。有研究報(bào)道，減少炎性因子可以保護(hù)大腦不受IR的影響[23]。研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇的抗炎作用相當(dāng)于地塞米松[24]，可以通過(guò)抑制IL-1β、IL-6和TNF-α達(dá)到抗炎的效果[25]。Fernández等[2]研究表明，對(duì)耳鼠局部給藥可以減輕TPA誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，羽扇豆醇局部應(yīng)用可降低髓過(guò)氧化物酶(中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記)水平，從而減少小鼠細(xì)胞向炎性組織浸潤(rùn)，可減少脂多糖處理的巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-β等促炎性因子的生成。有研究在支氣管哮喘小鼠模型中，觀察到羽扇豆醇通過(guò)降低Ⅱ型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平而緩解炎癥[24]，還可促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2，并改善實(shí)驗(yàn)性炎癥性腸病[26]。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)顯著增加，與模型組相比，不同濃度羽扇豆醇組IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，與上述研究結(jié)果一致。提示羽扇豆醇能減少促炎性細(xì)胞因子，降低IR炎性反應(yīng)。

綜上所述，羽扇豆醇可抑制IR損傷引起的細(xì)胞凋亡，降低IR氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)。已知文獻(xiàn)報(bào)道了其他藥物通過(guò)激活JAK-STAT減少細(xì)胞凋亡，改善IR損傷[27]，以后可以檢測(cè)相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步探索羽扇豆醇改善IR損傷分子機(jī)制。