陳國林，王學(xué)為，李 芳

（麗水市公安局刑偵支隊(duì)，浙江 麗水 323000）

骨骼是DNA檢驗(yàn)的一類特殊生物檢材，其具有致密組織結(jié)構(gòu)，DNA降解速度相對(duì)人體其他組織慢。對(duì)于高度腐敗和白骨化的尸體案件，骨骼是DNA檢驗(yàn)的首選檢材，但是由于其特殊的組織結(jié)構(gòu)及環(huán)境因素影響，骨骼DNA的提取較為困難。骨骼DNA鑒定的難點(diǎn)在于DNA拷貝低、有外源性DNA污染等[1]，因此保證充足的DNA模板量和避免外源性DNA污染是骨骼DNA檢驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

本文嘗試應(yīng)用ABI公司的PrepFiler BTA Forensic DNA試劑盒提取骨骼DNA，結(jié)合Global filerTMExpress試劑盒進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)，在4.5 h內(nèi)獲得理想的分型結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 檢材來源

檢材來源于本機(jī)構(gòu)日常檢案收取的自然災(zāi)害和分尸案中的骨骼樣本，共計(jì)37份。按人體部位分為顱骨5例，胸骨2例，椎骨8例，掌骨7例，跖骨4例，髕骨5例，股骨4例，脛骨2例；按尸體埋藏時(shí)間分為1～2周3例，2～3周5例，3～4周6 例，4～5周11例，5～6周4例，6～7周1例，7～8周1例，28～29周4例，41～43周2例。

1.2 方法

1.2.1 樣本預(yù)處理

用純水沖洗干凈骨骼表面，放通風(fēng)柜中干燥后，用75%酒精清洗，再晾干。之后，用手術(shù)刀片將骨骼表面附著物刮干凈，再用手術(shù)刀片切取或用壓碎機(jī)壓碎骨骼，取骨密質(zhì)或骨松質(zhì)骨碎片約15～100 mg。取樣時(shí)首選骨松質(zhì)，因其比骨密質(zhì)所含細(xì)胞量多，故DNA含量相對(duì)較多[2]，且骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，較易處理[3]。

1.2.2 DNA提取

將骨碎片置于1.5 mL離心管中，采用優(yōu)化的PrepFiler?BTA Forensic DNA試劑盒（ABI公司，美國）提取，步驟如下：1) 加入PrepFiler BTA Lysis Buffer 220 μL，Proteinase K（ABI公司，美國）10 ～20 μL，DTT 溶液（1 mol/ L）3 μL ；震蕩10 s，1000 r/min離心3 s后，將樣本管放在恒溫震蕩金屬浴孵育，56 ℃孵育1 h。2) 將樣品管用離心機(jī)10 000 r/min離心90 s，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，注意不要吸到沉積物，如果轉(zhuǎn)移的上清液過少，需添加PrepFile BTA Lysis Buffer至總體積180 μL。3) 在離心管中加入300 μL PrepFiler Lysis Buffer、15 μL 磁珠、300 μL異丙醇（99.5%分子級(jí)），震蕩10 s以上，在室溫中靜置10～20 min。4) 震蕩樣本管10 s，離心3 s，將樣本管放置在磁力架（ABI公司，美國）上靜置3 min，去除上清液，注意不要碰觸磁珠（下同）；加入600 μL PrepFiler Wash Buffer A洗滌液，從磁力架上取下樣本管震蕩10 s，離心3 s，將樣本管放置在磁力架上靜置1 min，去除洗滌液；再次加入300 μL PrepFiler Wash Buffer A洗滌液，重復(fù)上面的清洗步驟。5) 加入300 μL PrepFiler Wash Buffer B洗滌液，震蕩10 s，離心3 s，將樣本管放置在磁力架上靜置1 min，去除洗滌液；繼續(xù)在磁力架上晾干5 min。6)洗脫DNA：在管中加入20 μL的PrepFiler?Elution Buffer，震蕩至磁珠重懸，將離心管放置在金屬浴中70 ℃孵育10 min，最大速度震蕩離心管直到磁珠重懸再離心5 s，將離心管放置到磁力架上靜置3 min，直到磁珠穩(wěn)定，小心將所有的液體轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中備用。

1.3 PCR擴(kuò)增與檢測

使用Global filerTMExpress試劑盒（ABI公司,美國）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系10 μL，其中DNA模板溶液1 μL，PCR 反應(yīng)混合液9 μL（含有Master mix additive的Master Mix 4μL，Primer Mix 4 μL，純水1 μL）。采用9700型擴(kuò)增儀（ABI公司, 美國），參照試劑盒擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。采用3130xL型基因分析儀（ABI公司，美國）檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，應(yīng)用GeneMapper ID-X v1.4軟件進(jìn)行STR分型。

2 結(jié)果

37份骨骼樣本均獲得了Global filerTMExpress擴(kuò)增試劑盒中21個(gè)常染色體STR基因座和Amel基因座的分型結(jié)果，其中的13份男性骨骼樣本也獲得了試劑盒中2個(gè)Y染色體基因座的分型結(jié)果，各等位基因峰為200 ～ 7500 rfu，峰型較均衡，未見明顯非特異性峰型（圖1）。不同部位和不同埋藏時(shí)間骨骼樣本的STR分型檢驗(yàn)成功率均為100%。

圖1 1例埋藏7～8周的脛骨STR分型圖譜（Global filerT M Express擴(kuò)增試劑盒）Fig.1 STR genotyping pro file by Global filerT M Express to test one shinbone that was buried underground for 7-8 weeks

3 討論

傳統(tǒng)的骨骼DNA提取方法，步驟較繁瑣，耗時(shí)也長。本文方法步驟簡單、提取時(shí)間短且成功率高，優(yōu)點(diǎn)明顯，表現(xiàn)為：

1) 直接用刀片切取和壓碎機(jī)壓碎骨骼樣本，可防止研磨骨粉因產(chǎn)熱而所致的DNA降解[4]。

2) 所用試劑盒中的裂解液PrepFiler BTA Lysis Buffer裂解能力強(qiáng)，可直接裂解骨碎片且無需單獨(dú)進(jìn)行脫鈣處理。而傳統(tǒng)的骨骼DNA提取方法需要進(jìn)行單獨(dú)的脫鈣處理，會(huì)導(dǎo)致DNA的部分流失，遺棄的脫鈣液中往往含有大量的DNA，DNA損失會(huì)達(dá)50%以上[5]。而本文方法因無需作脫鈣處理，防止了DNA的丟失，提高了DNA的產(chǎn)量。

3) 所用試劑盒中的納米磁珠吸附核酸效果好，DNA回收率高，多次洗滌又保證了DNA的高純度。

4) 傳統(tǒng)骨骼DNA提取方法脫鈣時(shí)間較長，一般在12 ～ 24 h 以上[6-7]，而本文方法同時(shí)進(jìn)行脫鈣和裂解，直接裂解1 h即可，使DNA提取在2 h內(nèi)就能完成，結(jié)合Global filerTMExpress擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行快速擴(kuò)增，DNA分型檢驗(yàn)的整個(gè)過程在4.5 h就能完成，非常適合災(zāi)害事故遇難者身份識(shí)別（disaster victim identi fication, DVI）的身源鑒定。

5) 37份骨骼提取DNA樣本都獲得了擴(kuò)增試劑盒應(yīng)顯現(xiàn)的全部STR分型結(jié)果。該擴(kuò)增試劑盒的SE33基因座片段長度約306 ～ 444 bp，在低拷貝DNA擴(kuò)增時(shí)容易丟失等位基因，而在本實(shí)驗(yàn)中該等位基因未丟失。因此，本文方法提取骨骼DNA的濃度、純度都較高，檢驗(yàn)成功率高。

綜上所述，本文采用優(yōu)化的PrepFiler BTA Forensic DNA試劑盒法結(jié)合Global filerTMExpress擴(kuò)增試劑盒檢驗(yàn)骨骼DNA大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，具有操作簡便、試劑無毒、所需樣本量少、能快速獲得完整DNA分型等優(yōu)點(diǎn)，適合骨骼檢驗(yàn)使用，特別在DVI快速檢驗(yàn)中可選用。