王肖彬 安登坤 劉洋

摘 要：目的：提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量。方法：采用大腸桿菌K12菌株，含有表達(dá)某種抗體類(lèi)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的方式，檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間表達(dá)量變化情況，評(píng)估每種物質(zhì)對(duì)于目的蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的影響。結(jié)果：同時(shí)加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的發(fā)酵批次可溶性蛋白表達(dá)量最高。結(jié)論：說(shuō)明在大腸桿菌高密度發(fā)酵過(guò)程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表達(dá)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；高密度發(fā)酵；甲硫氨酸；亮氨酸；異亮氨酸；可溶性表達(dá)

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.17.032

大腸桿菌是目前常用的蛋白發(fā)酵菌體，采用高密度發(fā)酵技術(shù)（High cell density cultivation， HCDC）不僅可以減少培養(yǎng)體積、提高目的蛋白產(chǎn)量，還可以縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力[1]。但外源蛋白在獲得高水平表達(dá)的同時(shí)，容易形成包涵體，包涵體中的多肽鏈折疊錯(cuò)誤，沒(méi)有活性，必須通過(guò)復(fù)雜的復(fù)性過(guò)程才能獲得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特別是含二硫鍵較多的包涵體蛋白，在復(fù)性過(guò)程中容易發(fā)生二硫鍵的錯(cuò)配，從而使蛋白質(zhì)失去生物學(xué)活性。蛋白的可溶性表達(dá)則可避免變、復(fù)性過(guò)程，明顯簡(jiǎn)化后續(xù)純化工藝，保證功能蛋白的功能。因此，探索外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。

目前針對(duì)于高密度發(fā)酵過(guò)程中蛋白可溶性表達(dá)的研究主要停留在對(duì)大腸桿菌宿主細(xì)胞[3]、比生長(zhǎng)速率、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)[4]、誘導(dǎo)溫度[5]、培養(yǎng)基成分[6]、碳源種類(lèi)[7]、表達(dá)載體啟動(dòng)子[8]、融合標(biāo)簽[9]等。關(guān)于發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入氨基酸對(duì)可溶性蛋白表達(dá)的影響，國(guó)內(nèi)目前的相關(guān)研究報(bào)道偏少。國(guó)外研究表明，在大腸桿菌表達(dá)蛋白期間，正亮氨酸殘基的引入會(huì)導(dǎo)致正常合成的蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變[10]，引起可溶性蛋白表達(dá)量的降低。在發(fā)酵過(guò)程中，補(bǔ)入甲硫氨酸，可以確保細(xì)胞獲得過(guò)量的甲硫氨酸，從而減少了甲硫氨酰tRNA不正確的加載正亮氨酸的概率。甲硫氨酸的加入可以抑制正亮氨酸的作用[11]，從而維持菌體蛋白合成的正常結(jié)構(gòu)和功能。亮氨酸可以抑制酶參與正纈氨酸和正亮氨酸的合成，但是，亮氨酸同樣影響細(xì)胞功能造成發(fā)酵結(jié)束時(shí)的細(xì)胞密度偏低。額外加入的異亮氨酸，則可以極大得增加重組蛋白產(chǎn)量[12]。其他防止正亮氨酸錯(cuò)誤滲入細(xì)胞蛋白的方式還有刪除亮氨酸操縱子等[13]。

本文利用我公司現(xiàn)有的含有抗體質(zhì)粒的大腸桿菌K12菌株，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中分別加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，觀察對(duì)于目的蛋白可溶性表達(dá)量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑

甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖購(gòu)自西王藥業(yè)有限公司；胰蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.2 主要儀器

Bioflo415型發(fā)酵罐為NBS公司產(chǎn)品；電子天平為北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品；pH電極、溶氧電極為Pall公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)為長(zhǎng)沙市鑫奧儀器有限公司產(chǎn)品；電泳儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；AKTA純化系統(tǒng)為GE公司產(chǎn)品。

1.3 發(fā)酵方法

將保存于-70℃的大腸桿菌K12菌株轉(zhuǎn)種到LB培養(yǎng)基中，按0.2%接種量轉(zhuǎn)種，30℃，150r/min，過(guò)夜培養(yǎng)后作為一級(jí)種子。將一級(jí)種子按10%的接種量接種發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)維持溶氧30%以上，pH7.0±0.3左右，溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間約50 h。在OD550=40時(shí)分別補(bǔ)入終濃度為21mmol/L的甲硫氨酸、終濃度為12mmol/L的亮氨酸和終濃度為15mmol/L的異亮氨酸。不加入各種氨基酸的作為對(duì)照批次。發(fā)酵過(guò)程中測(cè)量菌液OD550，每隔5h取發(fā)酵液離心，收集菌體，稱取計(jì)量不同時(shí)間點(diǎn)的菌體濕重。

1.4 表達(dá)量檢測(cè)方法

取上述菌體15g進(jìn)行超聲破碎，將超聲后菌液離心，取上清，利用Protein G色譜柱，檢測(cè)可溶性蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 可溶性蛋白表達(dá)量

三種氨基酸同時(shí)補(bǔ)入的發(fā)酵批次可溶性表達(dá)量最高。補(bǔ)入甲硫氨酸和異亮氨酸的發(fā)酵批次與只補(bǔ)加異亮氨酸的發(fā)酵批次可溶性表達(dá)量接近，均高于對(duì)照批次。補(bǔ)入甲硫氨酸的發(fā)酵批次、補(bǔ)入亮氨酸和異亮氨酸的發(fā)酵批次可溶性表達(dá)量與對(duì)照批次相近。補(bǔ)入甲硫氨酸和亮氨酸的發(fā)酵批次與只補(bǔ)加亮氨酸的發(fā)酵批次表達(dá)量均明顯低于對(duì)照批次。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 下罐菌體濕重

以上幾批發(fā)酵菌體，補(bǔ)入甲硫氨酸和亮氨酸的發(fā)酵批次菌重較低，10L發(fā)酵液收得950g菌，補(bǔ)入亮氨酸的發(fā)酵批次下罐菌體濕重最小，10L發(fā)酵液僅收得880g菌。其余批次菌體濕重相近，均在1.2kg左右。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

高密度發(fā)酵是在保證生長(zhǎng)速率的前提下，盡可能提高細(xì)胞密度，使體積生產(chǎn)率大幅提高[14]。在大腸桿菌高密度發(fā)酵過(guò)程中，減少包涵體形成和提高蛋白可溶性表達(dá)，有助推動(dòng)基因工程蛋白藥物生產(chǎn)的發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步。

本文通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)比對(duì)，清晰反映出幾種氨基酸在大腸桿菌發(fā)酵可溶性蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮的不同作用。亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸均加入的發(fā)酵批次可溶性蛋白表達(dá)量要明顯高于只加入甲硫氨酸和異亮氨酸的發(fā)酵批次，說(shuō)明亮氨酸的加入有助于提高可溶性蛋白表達(dá)量。但同時(shí)，只加入亮氨酸的發(fā)酵批次其表達(dá)量是7批發(fā)酵批次中最低的，結(jié)合其對(duì)下罐菌量的影響，不難看出，亮氨酸會(huì)影響正常的細(xì)胞功能，造成細(xì)胞密度偏低。只加入甲硫氨酸和亮氨酸的發(fā)酵批次其可溶性蛋白表達(dá)量和菌量也低于對(duì)照批次，且明顯低于同時(shí)加入三種氨基酸的發(fā)酵批次，說(shuō)明異亮氨酸的加入可以抑制亮氨酸對(duì)細(xì)胞密度產(chǎn)生的不良影響。只加入亮氨酸和異亮氨酸的發(fā)酵批次其表達(dá)量與對(duì)照批次相近，再引入甲硫氨酸后表達(dá)量有了明顯提升，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入甲硫氨酸，確保細(xì)胞可以獲得過(guò)量的甲硫氨酸，可以保護(hù)目標(biāo)蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能特性，提高可溶性蛋白表達(dá)量。

從圖1中可以看出，在發(fā)酵25-30h，蛋白表達(dá)初期，不同批次發(fā)酵菌體可溶性蛋白表達(dá)量即出現(xiàn)明顯區(qū)分，發(fā)酵后期表達(dá)量變化不大。說(shuō)明可溶性蛋白表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)間在于表達(dá)初期，一旦目的蛋白過(guò)多得錯(cuò)誤折疊形成包涵體，在發(fā)酵后期很難再提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量。因此，幾種氨基酸應(yīng)在發(fā)酵前期、目的蛋白表達(dá)前進(jìn)行補(bǔ)加。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)分析，我們可以得出如下結(jié)論：在發(fā)酵前期加入亮氨酸有助于提高可溶性蛋白表達(dá)量，但同時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，造成菌體密度偏低；異亮氨酸則可以拮抗亮氨酸對(duì)細(xì)胞密度產(chǎn)生的不利影響；甲硫氨酸的加入可以明顯增加可溶性蛋白表達(dá)量，與上述兩種氨基酸一起協(xié)同作用的效果最優(yōu)。

綜上所述，在大腸桿菌高密度發(fā)酵前期同時(shí)補(bǔ)入甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，有助于提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]李民，陳常慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，2000，20（02）：26-31.

[2]劉爽，胡寶成.原核系統(tǒng)可溶性表達(dá)策略[J].生物技術(shù)通訊，2005，16（02）：172-175.

[3]劉啟剛，代云見(jiàn)，張勇俠等.抗IgE單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性高效表達(dá)條件的研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2012，32（11）：23-28.

[4]朱紅裕，李強(qiáng).外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)策略[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2006，6（01）：150-155.

[5]王園園，王金鳳，蔡欣等.重組人KGF-2的制備及生物學(xué)活性研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32（01）：34-38.

[6]余波，程安春，汪銘書(shū).大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)的研究進(jìn)展及展望[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（10）：19-20.

[7]楊彩云，杜慈，黃平等.重組AiiA蛋白可溶性表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（06）：1219-1227.

[8]李振國(guó)，徐明波，牛罡.在大腸桿菌周質(zhì)表達(dá)重組蛋白的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2011，18（01）：73-76.

[9]吳珊珊，朱蕓，陳珊珊等.融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2014，33（04）：993-998.

[10]M·K·萊爾德，K·維拉瓦力.用于防止正亮氨酸錯(cuò)誤地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)中的方法和組合物[P].中國(guó)專利：201380048535.X，2015-05-27.

[11]Nurit Bar-Nun，Alfred M.Mayer. Efferct of norleucine on growth，protein and catechol oxidase synthesis in tobacco suspension cultures[J].Phytochemistry，1985，24（10）：2161-2166.

[12]Macdonald，Andrew，C.，Abu-Absi，Nicholas，Inlow，Duane，et al.Preventing nor-valine and norleucine misincorporation in recombinant proteins[P].US Patent：2007005963，2007-09-13.

[13]Papaneophytou P，Kontopidis G.Statistical approaches to maximize recombina-nt protein expression in Escherichia coli：A general review[J].Protein Expression and Purification，2014（94）：22-32.

[14]謝萌，徐鑫，咸漠等.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)甲羥戊酸動(dòng)力學(xué)[J].生物加工過(guò)程，2015，13（06）：70-74.