王蕾 張毅 王旭東 葉子

針灸是一種治療疼痛的古老康復(fù)療法，其良好的止痛效果及修復(fù)功能已在臨床實(shí)踐中被證實(shí)[1]?；趥鹘y(tǒng)手工針灸改良后的電針也已被廣泛應(yīng)用并作為經(jīng)典針灸的替代治療[2]。前期研究認(rèn)為電針刺激可以明顯促進(jìn)損傷的展神經(jīng)恢復(fù)，但是相關(guān)機(jī)制尚不明確[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，既可以促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，又能產(chǎn)生細(xì)胞毒性，其雙重特性可能與不同表型及功能相關(guān)[4]。根據(jù)表型小膠質(zhì)細(xì)胞分為M1、M2型，小膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)激損傷環(huán)境中活化為M2型調(diào)節(jié)免疫炎癥損傷反應(yīng)，尤其小膠質(zhì)細(xì)胞上的大麻素2型受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）不僅可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化和遷移，還可通過(guò)激活CB2R降低其神經(jīng)毒性反應(yīng)，另外大麻素1型受體（cannabinoid receptor type 1，CB1R）能影響多種分子的表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受，亦具有神經(jīng)保護(hù)作用[5,6]。那么電針的抗傷害作用是否由CB2R激活介導(dǎo)參與，CB2R激活電針治療是否影響展神經(jīng)修復(fù)。基于此本文以電針為核心，利用小膠質(zhì)細(xì)胞為切入點(diǎn)，采用Western blot、免疫熒光分析技術(shù)，通過(guò)運(yùn)用CB2R拮抗劑AM630探討電針是否通過(guò)CB2R介導(dǎo)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M2型表達(dá)促進(jìn)損傷展神經(jīng)修復(fù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用普通級(jí)健康Beagle犬25只（6月齡），雌雄各半，體質(zhì)量（15±0.5）kg，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（蘇）：2008-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于單獨(dú)的犬房，可自由走動(dòng)，12 h給予光照-黑暗的周期循環(huán)模式，保證適宜的溫度進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療4周取材，動(dòng)物的處理遵守國(guó)家健康協(xié)會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南。

實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為5組，每組5只；前3組為假手術(shù)組（A組）、損傷組（B組）、電針處理組（C組）進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞大麻素受體的檢測(cè)，其余為拮抗劑組（D組）、溶劑組（E組），5組均進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子的檢測(cè)。A組：Beagle犬麻醉后，僅暴露分離展神經(jīng)，術(shù)中不進(jìn)行神經(jīng)損傷處理，縫合切口皮膚，在其他組電針刺激時(shí)進(jìn)行束縛，連續(xù)2周，每次持續(xù)15min；B組：Beagle犬麻醉后，制作展神經(jīng)損傷模型，在其他組電針刺激時(shí)進(jìn)行束縛，連續(xù)2周，每次持續(xù)15 min；C組：Beagle犬展神經(jīng)損傷模型建立后進(jìn)行電針刺激，連續(xù)2周，每次持續(xù)15 min；D組：CB2R拮抗劑AM630+展神經(jīng)損傷+電針刺激，每次電針刺激前3 h給予溶劑 3 mL/kg（ip）進(jìn)行腹腔注射；E 組：Vehicle+AM630+展神經(jīng)損傷+電針刺激，在每次電針刺激前30 min給予溶劑3 mL/kg（ip）進(jìn)行腹腔注射。

二、主要實(shí)驗(yàn)試劑

放射免疫沉淀試驗(yàn)（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（南京生興生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京康為生物科技有限公司）；兔抗 CB1多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；兔抗 CB2 多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；βtubulin單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（Sigma公司，英國(guó)）；磷酸緩沖鹽溶液（上海碧云天生物科技有限公司）；鼠抗 CD11b單克隆抗體（Serotec，Oxford公司，英國(guó)）；兔抗Arginase多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.展神經(jīng)損傷模型的建立：所有Beagle犬術(shù)前12 h禁食后注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）靜脈麻醉。將Beagle犬置于手術(shù)臺(tái)進(jìn)行側(cè)臥位，固定其頭顱，耳緣牽向尾側(cè)固定，麻醉充分開(kāi)顱后皮瓣翻向外側(cè)切除大腦半球，保留中腦組織，經(jīng)顳肌附著處縱向切開(kāi)。經(jīng)顳底入路開(kāi)顱，骨窗盡量靠近顱底，擴(kuò)大骨窗范圍（從眶后到顴弓前），并沿顳骨窗下緣切開(kāi)硬腦膜沿斜坡向上外方做一創(chuàng)口約3.5 cm×3.5 cm。經(jīng)巖顳韌帶下方進(jìn)入海綿竇充分暴露深部的展神經(jīng)。用有齒止血鉗擠壓夾閉展神經(jīng)30 s后，直視鉗壓處組織菲薄，切斷展神經(jīng)軸突但維持神經(jīng)鞘膜完整性，以犬眼球呈內(nèi)斜視為造模成功。

2.電針刺激：展神經(jīng)損傷模型制作完成后，將2個(gè)電極（5F導(dǎo)管）分別置入神經(jīng)損傷處兩側(cè)；向外方牽拉上下眼瞼，在瞼板與球結(jié)膜交界處充分暴露外直肌，將電極均插入外直肌，植入深度約3.0 mm，間距約4.0 mm，縫合切口固定電極。游離端自眼眶后下方引出固定，形成回路，術(shù)后連續(xù)2周給予電針刺激，每次持續(xù)15 min。參數(shù)設(shè)置：脈沖頻率為5 Hz，時(shí)程0.1 ms，強(qiáng)度1.0 V。A、B組僅束縛，不刺激，其他3組進(jìn)行電針刺激，參數(shù)設(shè)定一致。

3.Western blot檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞大麻素CB1R、CB2R表達(dá)：首先將A、B、C 3組進(jìn)行Western blot檢測(cè)，查看CB1R、CB2R分別在3組展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。將3組所有Beagle犬用10%水合氯醛進(jìn)行深度麻醉后，迅速用手術(shù)剪剪下展神經(jīng)節(jié)段，冰浴分離出少許神經(jīng)組織置于1 mL勻漿器球狀部位，盡量充分剪碎組織加入RIPA裂解緩沖液與苯甲基磺酰氟（1 mmol/L）混合30 min。收集裂解液并在4℃以12 000 r/min離心15 min，取上清分裝置于-20℃保存，提取小膠質(zhì)細(xì)胞的總蛋白，蛋白質(zhì)含量用量化增強(qiáng)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，蛋白質(zhì)樣本煮沸5 min，裝載緩沖液并進(jìn)行蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳，后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜膜上， 取出膜放至 5%TBST（Tris-Hcl，NaCl，tween20）脫脂奶粉，以60 r/min的速度封閉2 h，經(jīng)過(guò)漂洗加入下列抗體：兔抗CB1多克隆抗體（1∶200）或兔抗 CB2多克隆抗體（1∶200）和 β-tubulin單克隆抗體（1∶200），放置 4℃冰箱孵育過(guò)夜，TBS 漂洗后加入Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶5000）。最后加入SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物。進(jìn)行凝膠圖像的密度測(cè)定分析使用Image J軟件（NIH，Bethesda，MD，美國(guó)）。

4.免疫熒光分析：將5組展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞均進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，檢測(cè)CD11b陽(yáng)性細(xì)胞和Arginse免疫反應(yīng)細(xì)胞的表達(dá)情況。將神經(jīng)組織固定取，將切片在室溫中放置2 h，每個(gè)切片晾干后，放入洗片盒內(nèi)，在磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中洗滌3次，5 min/次。然后放入封片盒中，待水分基本晾干，使用含5%驢血清和0.2%teen-20 PBS封閉，37℃過(guò)1 h，然后分別加入鼠抗CD11b 單克隆抗體（1∶200）鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞，兔抗Arginase多克隆抗體（1∶100）鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞 M2型。4℃過(guò)夜后PBS洗滌3次，5 min/次。再加入Dylight 594（1∶400）結(jié)合熒光標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)和 Dylight 488（1∶400）結(jié)合熒光標(biāo)記的抗山羊IgG，4℃避光孵育2 h。孵育完畢后使用PBS洗滌3次，5 min/次。使用抗熒光衰減避光封片，使用共聚焦顯微鏡（FV500-IX71，Olympus，日本）觀(guān)察并照相。合并面板是疊加圖像，顯示兩重標(biāo)記的單元格。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2 型標(biāo)志分子表達(dá)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，5組Arginse/CD11b比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、電針刺激后犬CB1R、CB2R表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，B、C組與A組比較，CB1R蛋白的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而電針刺激處理明顯增加了CB2R蛋白的表達(dá)量。電針預(yù)處理持續(xù)15 min連續(xù)2周后，C組CB2R的蛋白表達(dá)量顯著高于A(yíng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而A組與B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳細(xì)信息見(jiàn)圖1。

圖1 電針刺激后犬大麻素受體表達(dá)情況

二、電針與小膠質(zhì)細(xì)胞M2型表達(dá)相關(guān)性

免疫熒光檢測(cè)顯示，5組小膠質(zhì)細(xì)胞均能檢測(cè)到CD11b陽(yáng)性細(xì)胞和Arginse免疫反應(yīng)細(xì)胞（圖2）。C組經(jīng)電針治療后Arginse/CD11b的表達(dá)較A組增高（P＜0.05）；而 B、D 組與 A 組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，E組經(jīng)溶劑處理后，Arginse/CD11b的表達(dá)較 A 組增高（P＜0.05）（圖 3）。

討 論

圖2 5組展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型免疫熒光檢測(cè)（×20）

圖3 5組Arginse/CD11b細(xì)胞的表達(dá)水平比較

近年來(lái)通過(guò)減緩、阻止或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性的神經(jīng)保護(hù)策略，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)在神經(jīng)退行性病變中的病理作用已成為研究熱點(diǎn)。目前，神經(jīng)退行性疾病的多重致病假說(shuō)已將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向了其他促成病理因素，特別是神經(jīng)炎癥。神經(jīng)炎癥維持神經(jīng)退行性改變，形成周期性和自我維持的病理過(guò)程，影響細(xì)胞因子產(chǎn)生、免疫細(xì)胞遷移、抗原表達(dá)和病原體清除，一旦小膠質(zhì)細(xì)胞遷移M1表型被激活將會(huì)殺死更多的神經(jīng)元。相關(guān)研究認(rèn)為作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞已被證實(shí)與缺血性腦卒中密切相關(guān)，因此抗炎和免疫抑制劑CB2R引起充分的關(guān)注[7-9]。在帕金森病患中，前期臨床研究瞄準(zhǔn)CB1R作為神經(jīng)保護(hù)劑的策略不太成功，一些證據(jù)表明CB2R在腦部損傷部位表達(dá)增加，CB2R能夠刺激細(xì)胞因子的釋放和免疫細(xì)胞的應(yīng)答，減少抗原呈遞，調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)。有研究表明使用CB2R選擇性激動(dòng)劑0-1996能顯著減輕創(chuàng)傷性腦損傷后的腦水腫和小膠質(zhì)細(xì)胞積聚，能夠促進(jìn)受損功能恢復(fù)[10]。電針對(duì)炎性疼痛及神經(jīng)損傷的修復(fù)作用已得到臨床認(rèn)可，可減少患者痛苦、調(diào)節(jié)釋放促炎性細(xì)胞因子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)電針刺激處理后CB1R蛋白的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化；而電針刺激持續(xù)15 min連續(xù)2周后CB2R蛋白的表達(dá)量明顯增加，且與假手術(shù)組比較，CB2R的蛋白表達(dá)量顯著增高，因此筆者認(rèn)為CB2R主要參與電針刺激誘導(dǎo)神經(jīng)損傷保護(hù)作用。

有研究進(jìn)一步對(duì)電針與小膠質(zhì)細(xì)胞M2型表達(dá)的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞能誘發(fā)一系列的抗氧化反應(yīng)，抑制缺血后活性氧產(chǎn)生，抑制促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 產(chǎn)生，減少神經(jīng)元死亡[12,13]。而M2型表面抗原主要表達(dá)為Arginase、Ym-1和CD206等，Arginase能預(yù)防細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞遷移，促進(jìn)功能性突觸形成而降低神經(jīng)元損害[14,15]。本研究檢測(cè)了電針預(yù)處理對(duì)展神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理能夠顯著升高M(jìn)2型標(biāo)志分子Arginase的表達(dá)，促使小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。電針預(yù)處理能通過(guò)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)誘導(dǎo)展神經(jīng)修復(fù)，筆者選用CB2R拮抗劑AM630影響CB2R的表達(dá)，觀(guān)察其是否對(duì)展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)產(chǎn)生影響，發(fā)現(xiàn)AM630能拮抗電針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響。本研究保持了神經(jīng)鞘膜的完整性，保留了神經(jīng)電活動(dòng)的傳導(dǎo)連續(xù)性，結(jié)果表明電針能夠減少炎癥刺激，起到神經(jīng)損傷修復(fù)保護(hù)作用，其機(jī)制可能為小膠質(zhì)細(xì)胞M2型被活化介導(dǎo)相關(guān)，電針通過(guò)CB2R介導(dǎo)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M2型表達(dá)促進(jìn)損傷展神經(jīng)修復(fù)。

綜上所述，本研究運(yùn)用Beagle犬展神經(jīng)損傷模型，通過(guò)電針對(duì)展神經(jīng)的刺激，證實(shí)電針能夠通過(guò)CB2R顯著升高M(jìn)2型標(biāo)志分子Arginase的表達(dá)，提示CB2R可能參與電針處理產(chǎn)生展神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，延緩展神經(jīng)損傷，促進(jìn)修復(fù)。