諶鴻超，蔣 靜，鄭 江，樊彥莉，張舒亞，楊捷琳

(上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

甜菜是重要的糖料作物，榨糖后的甜菜粕是重要的動物飼料。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因甜菜種植及應(yīng)用日益廣泛。自2006年轉(zhuǎn)基因甜菜被美國批準商業(yè)化種植以來，轉(zhuǎn)基因甜菜在美國和加拿大被廣泛種植，2011年轉(zhuǎn)基因甜菜占美國甜菜種植面積的95%，2014年為98.5%，2015—2016年為100%。2016年加拿大甜菜種植也均為轉(zhuǎn)基因甜菜，并被批準用于食用和飼用[1]。目前，商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因甜菜有3個品系，分別為轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1(抗草甘膦)、轉(zhuǎn)基因甜菜GTS B77(抗草甘膦)和轉(zhuǎn)基因甜菜T120-7(抗草銨膦)，均為抗除草劑。目前大面積種植的是抗草甘膦甜菜H7-1品系，是Monsanto公司產(chǎn)品，轉(zhuǎn)入的外源基因主要有FMV35s、E9 3’、cp4epsps和ctp2[2]。

目前對于轉(zhuǎn)基因生物安全性還有爭議，歐盟、日本、中國出臺了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標簽法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實施標識。根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《進口用作加工原料的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物審批情況》，我國僅批準了轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系用作加工原料，該品系的進口有效期截止到2018年5月8日[3]。質(zhì)檢總局在2016年發(fā)布《進口美國甜菜粕檢驗檢疫要求的公告》(2016年第97號)，自2016年9月起允許美國甜菜粕進口[4]。根據(jù)法規(guī)及相關(guān)進出口要求，張舒亞等[2]建立了轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1的實時熒光PCR檢測方法，也建立了轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1的PCR檢測方法標準[2,5]。PCR方法由于具有高特異性、高靈敏度被廣泛應(yīng)用，然而該方法需配置高精尖儀器，技術(shù)要求較高，不適用于現(xiàn)場快速檢測。目前口岸一線和企業(yè)自控需要有簡便快速、不需精密儀器和專業(yè)人員的現(xiàn)場快速檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是近年來發(fā)展的一種新穎的和較成熟的等溫核酸擴增技術(shù)。與PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)儀(PCR儀)，且LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產(chǎn)物通過肉眼觀察或濁度計即可判定結(jié)果。該方法操作簡單，易于推廣，對設(shè)備和檢測人員要求較低，更適用于口岸簡易實驗室和進出口企業(yè)，可實現(xiàn)快速、準確的檢測，該技術(shù)并已在核酸的科學研究、病原微生物鑒定等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[6-9]。本研究擬將LAMP技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1的檢測，以期建立轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；甜菜堿(Betaine)、MgCl2，Sigma公司；dNTPs，寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green I 熒光染料，Invitrogen公司；E.Z.N.A.? HP Plant DNA Kit，OMEGA公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1樣品、其他植物樣品及加工產(chǎn)品為實驗室保留樣品。

儀器：離心機；漩渦混合器；LAMP實時濁度儀；LA-320C，日本榮研化學株式會社；BioPhotometer plus核酸蛋白含量測定儀，德國Eppendorf公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜邊界序列設(shè)計一套特異性引物，包括：

上游外引物(F3)：AACACTTAGCTTGGGACAA；

下游外引物(B3)：TGATTGAACCCAATCTGGA；

上游內(nèi)引物(FIP)：CCGTAATGAGAAGAGAGAAACATCATATTTCTTAATTTTTGCAGGCGA；

下游內(nèi)引物(BIP)：TCTGGGTGGCTCTAACTATTTACATTTT-CTCAAGCTTGATGGGGAT；

上游環(huán)引物(LF)：AACACAAAATGCTCATAACAGCCAC；

下游環(huán)引物(LB)：CTGAAGGCGGGAAACGACAA。

外引物擴增片段長度為237 bp。

1.3 樣品制備及DNA提取

取100%轉(zhuǎn)基因甜菜和0%轉(zhuǎn)基因甜菜標準品(購買自IRMM)，按質(zhì)量比將上述兩種樣品混合成轉(zhuǎn)基因成分質(zhì)量分數(shù)為5%、1%、0.5%的待測樣品。

樣品DNA的提取使用E.Z.N.A.?HP Plant DNA Kit，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 體系建立和引物篩選

初步確定25 μL的LAMP反應(yīng)體系：FIP和BIP各1.6 μmolL，F(xiàn)3和B3各0.2 μmolL，LF和LB各0.8 μmolL，20 mmolL Tris-HCl(pH 8.8)，10 mmolL KCl，8 mmolL MgSO4，10 mmolL (NH4)2SO4，0.1% Tween20，1 molL甜菜堿，6 mmolL MgSO4，1.6 mmolL dNTP，8 U Bst大片斷DNA聚合酶，2 μL DNA引物。用100%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1標準品作為模板進行引物的初步篩選，同時以無菌水作為陰性對照。使用LAMP濁度儀觀察，63℃恒溫反應(yīng)60 min，最后80℃下保溫5min結(jié)束反應(yīng)，根據(jù)出峰時間及陰陽性符合率初步篩選引物。

1.5 特異性試驗

選擇24個植物轉(zhuǎn)基因品系，分別為：轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1(A1)、GM棉花MON531(A2)、GM大豆GTS40-3-2 (A3)、GM大米Bt63 (A4)、GM油菜MS8×RF3(A5)、轉(zhuǎn)基因玉米GA21(A6)、轉(zhuǎn)基因玉米MON810 (A7)、轉(zhuǎn)基因玉米MM88(A8)、轉(zhuǎn)基因玉米MON863(B1)、轉(zhuǎn)基因玉米MON88017(B2)、轉(zhuǎn)基因玉米NK603(B3)、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604(B4)、轉(zhuǎn)基因玉米MON89034(B5)、轉(zhuǎn)基因玉米CBH351(B6)、轉(zhuǎn)基因玉米BT11(B7)、轉(zhuǎn)基因玉米BT176(B8)、轉(zhuǎn)基因玉米EVENT98140(C1)、轉(zhuǎn)基因土豆EH92-527-1(C2)、轉(zhuǎn)基因大豆DP305423(C3)、轉(zhuǎn)基因大豆DP356043(C4)、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2(C5)、轉(zhuǎn)基因水稻‘科豐6號’(C6)、轉(zhuǎn)基因水稻‘科豐8號’(C7)、轉(zhuǎn)基因油菜GT73(C8)。

使用上述建立的LAMP反應(yīng)體系進行試驗，評估其特異性，使用LAMP濁度儀觀察結(jié)果。

1.6 靈敏性試驗

使用建立的LAMP反應(yīng)體系對轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系成分質(zhì)量分數(shù)為0%、0.1%、0.5%、1%的樣品進行檢測，評估其靈敏度。

1.7 穩(wěn)定性試驗

分別對4個不同質(zhì)量分數(shù)(空白樣品0%、添加水平0.5%、1%、5%)的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1樣品進行檢測，每個樣品重復(fù)20次，評估方法的穩(wěn)定性。

1.8 一致性試驗

為驗證方法的準確性，選取36份樣品作為待測樣品，包括非轉(zhuǎn)基因甜菜、其他植物樣品及加工產(chǎn)品、非目的轉(zhuǎn)基因成分的其他轉(zhuǎn)基因樣品，轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1及含轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1成分的植物模擬樣品及加工產(chǎn)品。使用建立的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1實時濁度LAMP檢測和顯色法LAMP檢測，并使用歐盟發(fā)布的官方檢測方法熒光PCR法進行驗證，比較檢測結(jié)果與熒光PCR方法結(jié)果的一致性。

CH1—2：陰性對照(非轉(zhuǎn)基因甜菜)；CH3—4：陽性對照(轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1)圖1 轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系引物LAMP篩選結(jié)果Fig.1 LAMP screening results of primers for genetically modified sugar beet H7-1

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和體系優(yōu)化

結(jié)果顯示，設(shè)計的LAMP引物具有較好的特異性，轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1標準品具有明顯擴增，而陰性對照未出現(xiàn)擴增(圖1)。在引入環(huán)引物后，縮短了反應(yīng)時間，初步確認后續(xù)試驗反應(yīng)時間為60 min。

2.2 LAMP檢測方法的特異性試驗

對24個植物轉(zhuǎn)基因品系進行LAMP反應(yīng)體系特異性驗證，除轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系(A1)出現(xiàn)擴增外，其余樣品均未出現(xiàn)擴增(圖2)，表明該方法具有特異性。

圖2 轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系LAMP特異性檢測Fig.2 Specificity detection of genetically modified sugar beet H7-1 by LAMP

D1：陽性對照；D2：5%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1；D3：1%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1；D4：0.5%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1；D5：0.1%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1；D6：0%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1圖3 轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系的實時濁度LAMP檢測靈敏度Fig.3 Sensitivity detection of genetically modified sugar beet H7-1 by real-time turbidity LAMP

2.3 LAMP檢測方法的靈敏性試驗

實時濁度LAMP檢測結(jié)果顯示：質(zhì)量分數(shù)5%、1%和0.5%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1樣品均出現(xiàn)擴增，0.1%和0%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1樣品未出現(xiàn)擴增，表明該方法體系的檢測下限為0.5%(圖3)。顯色法LAMP結(jié)果顯示：質(zhì)量分數(shù)1%、0.5%的轉(zhuǎn)基因甜菜LAMP反應(yīng)呈現(xiàn)綠色，檢測為陽性；0%、0.1%轉(zhuǎn)基因甜菜樣品LAMP反應(yīng)呈黃色，檢測為陰性(圖4)。由此可見，顯色法LAMP可以檢測出轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分數(shù)低至0.5%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系。

2.4 LAMP檢測方法的穩(wěn)定性試驗

對質(zhì)量分數(shù)5%、1%、0.5%和0%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1樣品進行LAMP檢測，并重復(fù)20次。結(jié)果顯示，質(zhì)量分數(shù)5%、1%和0.5%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1反應(yīng)呈綠色，0%轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1反應(yīng)呈黃色，LAMP檢測準確率達到100%(圖5)，表明該方法檢測甜菜中甜菜H7-1品系轉(zhuǎn)基因成分穩(wěn)定性較好。

2.5 LAMP檢測方法與實時熒光PCR檢測方法的一致性試驗

結(jié)果顯示，兩種方法對于特異性檢測結(jié)果一致。本研究建立的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1實時濁度LAMP檢測和顯色法LAMP檢測，對質(zhì)量分數(shù)0.5%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1能特異性擴增，而低于0.1%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1及其他非目的基因轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不出現(xiàn)擴增，而實時熒光PCR方法能檢出質(zhì)量分數(shù)0.1%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1樣品(表1)。

(續(xù)表1)

3 討論

轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系在美國和加拿大分別于2006年和2008年被批準種植，并已在美國、加拿大、澳大利亞、哥倫比亞、智利、中國等國被批準食用和(或)飼用，但轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題一直備受爭議。歐盟、日本、加拿大、澳大利亞、中國等實施了轉(zhuǎn)基因食品標識法規(guī)。為應(yīng)對相關(guān)法規(guī)要求，我國建立了相關(guān)轉(zhuǎn)基因成分檢測方法標準。對轉(zhuǎn)基因成分的檢測標準，基本上是基于蛋白質(zhì)的ELISA檢測方法和基于基因的PCR檢測方法，這需要使用較專業(yè)和昂貴的檢測設(shè)備,并需要專業(yè)人員操作。隨著技術(shù)的發(fā)展以及企業(yè)和一線對于現(xiàn)場快速檢測的要求等，目前急需要現(xiàn)場能快速和便捷檢測的技術(shù)和方法。本試驗利用LAMP技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系的快速檢測方法，通過體系優(yōu)化，對該方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性進行了驗證，結(jié)果表明建立的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1的LAMP檢測方法特異性強，穩(wěn)定性好，靈敏度高，可檢出轉(zhuǎn)基因含量高于質(zhì)量分數(shù)0.5%的轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1品系；通過對特定樣品的檢測，檢測結(jié)果與歐盟規(guī)定的熒光PCR方法結(jié)果一致，可用于轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1的快速檢測，能夠滿足法規(guī)要求，建立的檢測方法可適用于口岸一線檢驗檢疫需要以及企業(yè)的自控檢測要求。然而，目前建立的LAMP檢測方法只能用于定性檢測，不能定量，使用LAMP檢測技術(shù)進行定量檢測需要進一步研究。