查 倩，奚曉軍，和雅妮，蔣愛(ài)麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所，上海 201403)

溫度是影響葡萄生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)的主要因子，夏季持續(xù)的高溫環(huán)境會(huì)影響葡萄植株生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育，表現(xiàn)為葉片卷曲失水干枯，果實(shí)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的日灼[1]，造成不可逆的經(jīng)濟(jì)損失。

高溫逆境會(huì)破壞植物體內(nèi)活性氧的平衡狀態(tài)，屬于氧化還原脅迫[2-4]。植物往往通過(guò)提高抗氧化酶活性，減少自由基的傷害，來(lái)應(yīng)答逆境[5-6]。超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等均參與植物抗氧化反應(yīng)[7]，大多數(shù)植物SOD、POD(過(guò)氧化物酶)、CAT的酶活性在高溫下表現(xiàn)出增多現(xiàn)象[8-9]，并且高溫會(huì)導(dǎo)致植物組織中的丙二醛(MDA)等有害物質(zhì)增多[10]。

此外，高溫逆境下植物會(huì)產(chǎn)生一系列生理生化過(guò)程，其中光合作用最為敏感[11]，研究表明高溫處理會(huì)破壞PS II光化學(xué)系統(tǒng)，尤其表現(xiàn)在抑制植物光合電子傳遞，降低葉片光化學(xué)效率，導(dǎo)致植物不能有效利用吸收的光能，最終破壞光合中心機(jī)構(gòu)[12-15]。高溫脅迫誘發(fā)有機(jī)體合成一系列熱激蛋白HSPs，其中分子量為15—30 ku的蛋白是sHSPs，會(huì)參與保護(hù)PS II光化學(xué)反應(yīng)[16-17]。目前，sHSPs蛋白與植物耐熱性相關(guān)研究較多[18-19]。

孫軍利等[20]研究認(rèn)為葡萄高溫逆境與氧化還原平衡關(guān)系密切，Luo等[21]發(fā)現(xiàn)葡萄葉片的光合作用受溫度影響顯著。我國(guó)南方地區(qū)主要種植歐美雜種系葡萄品種，并常出現(xiàn)40 ℃以上極端高溫天氣，不同葡萄品種在高溫逆境下的差異應(yīng)答反應(yīng)的比較目前還沒(méi)有報(bào)道。為了探明不同遺傳背景葡萄品種的高溫應(yīng)答過(guò)程，本研究開(kāi)展了歐美雜種系葡萄高溫逆境應(yīng)答反應(yīng)研究，以便為南方地區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2014年12月—2015年10月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行。葡萄品種有‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申豐’‘申華’和‘滬培1號(hào)’，均屬于歐美雜交品種(V.Vinifera×V.LabruscaL.)。

將一年生盆栽葡萄扦插苗種植于直徑30 cm、高度40 cm的塑料盆內(nèi)，培養(yǎng)介質(zhì)為椰糠∶腐殖土 = 1∶1。試驗(yàn)在智能人工氣候培養(yǎng)箱(PRX-1000C，杭州錢(qián)江儀器設(shè)備有限公司)中進(jìn)行，設(shè)定白夜持續(xù)時(shí)間分別為14 h10 h，相對(duì)濕度保持在65%—70%，白夜溫度保持在(25±1) ℃(20±1) ℃，光合有效輻射為 200 μmol·m-2·s-1。

待植株長(zhǎng)至20—25片功能葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行25 ℃、35 ℃、45 ℃溫度處理，設(shè)置處理時(shí)間為每天的10：00—16：00，其他時(shí)間段(白夜)溫度保持(25±1) ℃(20±1) ℃。每個(gè)小區(qū)選5株葡萄，設(shè)置3個(gè)小區(qū)。不同溫度梯度分別處理3 h、6 h及150 h后，選第7—9片功能葉進(jìn)行無(wú)損傷的葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定，重復(fù)10次，并取葉片凍存在-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)，用于SOD活性、MDA含量和HSP21蛋白表達(dá)的檢測(cè)，重復(fù)3次。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 抗氧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑NBT法[22]；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸TBA顯色法[23]。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

利用連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Pocket PEA，Hansatech，英國(guó))無(wú)損傷測(cè)定葡萄葉片葉綠素快相熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定前進(jìn)行20min暗適應(yīng)處理，OJIP曲線由3 000 μmol·m-2·s-1紅光誘導(dǎo)，測(cè)定時(shí)間為1s。

葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)意義：FvFm=ΦPo為PSII光化學(xué)反應(yīng)中最大光化學(xué)效率；PIABS為以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)；ΨEo為反應(yīng)中心捕獲的激子中用來(lái)推動(dòng)電子傳遞時(shí)到電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其他電子受體的激子占用來(lái)推動(dòng)QA還原激子的比率；ΦEo為用于電子傳遞的量子產(chǎn)額；Wk為K相可變熒光占J相可變熒光的比例；RCQA為單位反應(yīng)中心激活PSII反應(yīng)中心的能量；δRo為電子從系統(tǒng)間電子傳遞體傳遞給光系統(tǒng)I(PS I)受體側(cè)電子受體的概率[13]。

1.2.3 HSP21蛋白表達(dá)分析

采取有機(jī)溶劑法提取蛋白質(zhì)[24]，并用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。提取的20μg蛋白樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% SDS-PAGE配置膠中電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗Anti-HSP21(Abcam，England，1∶3 000)[25]，4 ℃孵育過(guò)夜后加入二抗Anti-rabbit IgG(H+L)(CST，USA，1∶1 000)，室溫放置1 h后，浸于電化學(xué)發(fā)光試劑中顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫逆境下不同葡萄品種的表型變化

在25 ℃和35 ℃處理下，各品種葡萄植株生長(zhǎng)狀態(tài)和表型較為良好。45 ℃處理6 h時(shí)‘申華’和‘夏黑’頂梢和幼嫩葉片表現(xiàn)出失水枯萎癥狀，但仍然有健康的功能葉片，并持續(xù)到150 h時(shí)；45 ℃處理3 h時(shí)，‘巨峰’和‘巨玫瑰’頂梢就出現(xiàn)失水枯萎癥狀，6 h后植株大面積的失水枯萎，150 h表現(xiàn)為整株干枯；‘申豐’‘醉金香’和‘滬培1號(hào)’在45 ℃處理3 h時(shí)植株葉片出現(xiàn)大面積失水枯萎，6 h后整株干枯。觀察表型變化可知‘申華’和‘夏黑’品種的幼樹(shù)具有較好的抗高溫性能(圖1)。

A—G為25 ℃ 處理下的‘申華’‘夏黑’‘巨峰’‘巨玫瑰’‘申豐’‘滬培1號(hào)’‘醉金香’；a—g為45 ℃處理下‘申華’‘夏黑’‘巨峰’‘巨玫瑰’‘申豐’‘滬培1號(hào)’‘醉金香’圖1 25 ℃和45 ℃處理下6 h時(shí)不同葡萄品種表型觀察Fig.1 The phenotypic observation of different grape cultivars at 6 h under 25 ℃ and 45 ℃ treatments

圖2 不同溫度處理下不同葡萄品種SOD活性變化Fig.2 The changes of SOD activity in different grapecultivars under different temperature treatments

2.2 高溫下不同葡萄品種SOD活性和MDA積累量的變化

如圖2所示，‘申華’的SOD活性在35 ℃處理6 h時(shí)增強(qiáng)明顯，150 h時(shí)恢復(fù)至原初水平，45 ℃處理 3 h時(shí)SOD活性最高，隨后恢復(fù)至原初水平；‘夏黑’的SOD活性在35 ℃下變化不明顯，而45 ℃處理 3—6 h時(shí)略有降低；‘巨峰’‘巨玫瑰’和‘滬培1號(hào)’在高溫下SOD活性變化均不明顯；‘申豐’和‘醉金香’在35 ℃處理SOD活性變化不大，而在45 ℃處理3 h時(shí)SOD活性較高。以上可知，高溫逆境下不同葡萄品種氧化還原平衡調(diào)節(jié)方式有所不同。

由圖3可知，‘申華’在高溫處理下(35 ℃、45 ℃)MDA含量沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化；‘夏黑’和‘巨玫瑰’在35 ℃和45 ℃處理下MDA含量均有增加的現(xiàn)象；‘巨峰’‘申豐’‘滬培1號(hào)’僅在45 ℃處理MDA含量增加，其中‘滬培1號(hào)’表現(xiàn)最為明顯；‘醉金香’在高溫處理下MDA含量變化不顯著。

圖3 不同溫度處理下不同葡萄品種MDA含量變化Fig.3 The changes of MDA in different grapecultivars under different temperature treatments

2.3 高溫對(duì)不同葡萄品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖4可知，與25 ℃處理相比，7個(gè)品種在35 ℃處理下FvFm值沒(méi)有顯著變化，但在45 ℃處理下不同品種間FvFm值的變化不同?！耆A’在45 ℃處理3 h時(shí)FvFm值下降，6 h時(shí)有所恢復(fù)，150 h時(shí)恢復(fù)至原初水平；‘夏黑’在45 ℃處理3 h和6 h時(shí)FvFm值在降低，150 h時(shí)也恢復(fù)至原初水平；‘巨峰’在45 ℃處理3 h至6 h時(shí)FvFm值持續(xù)下降；‘巨玫瑰’45 ℃處理3 h時(shí)FvFm值下降，并在6 h時(shí)恢復(fù)至原初水平；‘申豐’‘滬培1號(hào)’和‘醉金香’在高溫3 h時(shí)FvFm值都明顯下降。由上可知，45 ℃處理3 h時(shí)葡萄葉片PS II反應(yīng)中心較為活躍。

圖4 不同溫度處理下不同葡萄品種FvFm值變化Fig.4 The changes of FvFm in different grape cultivars under different temperature treatments

由表1可知，35 ℃處理下不同葡萄品種的PS II活性未受到顯著影響，僅‘巨峰’的部分參數(shù)值在35 ℃處理3 h時(shí)增多，已知PIABS值由光能的吸收效率(ΦPo)、反應(yīng)中心對(duì)光能的轉(zhuǎn)換效率(ΨEo)及電子傳遞效率(ΦEo)組成，說(shuō)明一定程度的高溫逆境會(huì)增強(qiáng)‘巨峰’PS II反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率和電子傳遞效率，除‘巨蜂’外的其他6個(gè)品種35 ℃處理的PIABS值與25 ℃處理無(wú)明顯差異。但在45 ℃處理下7個(gè)葡萄品種的PIABS值均減少，其中‘申華’‘夏黑’‘巨峰’和‘巨玫瑰’的PIABS值降至0.2—0.6，‘申豐’‘滬培1號(hào)’和‘醉金香’的PIABS值降至0.0—0.2，同時(shí)伴隨著ΦPo、ΨEo和ΦEo值的減少，說(shuō)明極端高溫(45 ℃)會(huì)降低反應(yīng)中心的光能吸收效率和后續(xù)過(guò)程效率。

35 ℃高溫下7個(gè)葡萄品種的Wk、δRo和RCQA值與25 ℃無(wú)明顯差異，但在45 ℃高溫下7個(gè)品種的Wk值和δRo值幾乎均顯著性增多，而RCQA值均有明顯減少，其中‘申豐’‘滬培1號(hào)’和‘醉金香’的變化幅度更大。

表1 不同溫度處理3 h時(shí)不同葡萄品種其他熒光參數(shù)比較

注：*表示一個(gè)參數(shù)在同一葡萄品種中其他溫度處理與25 ℃處理間的顯著性差異(P<0.05)

2.4 高溫逆境下抗逆蛋白HSP21表達(dá)量變化

45 ℃處理逆境響應(yīng)蛋白HSP21表達(dá)的檢測(cè)見(jiàn)圖5，結(jié)果表明：HSP21的蛋白表達(dá)與處理時(shí)間和葡萄品種均有關(guān)系，處理3—6h，‘申華’ HSP21蛋白持續(xù)積累，6 h時(shí)最多，150 h時(shí)略有減少；‘夏黑’3 h時(shí)有較小幅度的積累，6—150 h積累量顯著減少；‘巨峰’高溫下3—6 h，蛋白積累增多；‘巨玫瑰’在3 h時(shí)蛋白積累較明顯；‘滬培1號(hào)’‘醉金香’和‘申豐’這3個(gè)品種在高溫處理后HSP21蛋白量減少明顯，這可能與不同品種的耐高溫能力差異有關(guān)。

圖5 45 ℃處理下不同葡萄品種HSP21蛋白表達(dá)Fig.5 The HSP21 levels of different grape cultivars under 45 ℃ treatment

3 討論與結(jié)論

熱害是植物對(duì)高溫逆境最為直觀的反應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)，在25 ℃、35 ℃處理下7個(gè)鮮食葡萄品種的植株形態(tài)表現(xiàn)均良好。45 ℃處理下不同品種表現(xiàn)不同，‘夏黑’和‘申華’在處理3—6 h時(shí)有失水萎蔫出現(xiàn)，在150 h時(shí)得到恢復(fù)，‘巨峰’和‘巨玫瑰’在處理6 h時(shí)葉片大面積失水干枯，處理3 h時(shí)‘滬培1號(hào)’‘醉金香’和‘申豐’葉片就會(huì)大面積失水直至干枯。綜上，7個(gè)品種中‘夏黑’和‘申華’在極端高溫(45 ℃)下植株的形態(tài)表現(xiàn)良好，‘巨峰’和‘巨玫瑰’次之，‘滬培1號(hào)’‘醉金香’和‘申豐’表現(xiàn)差。

高溫逆境下，植物葉片氧化脅迫加劇，MDA等有害物質(zhì)含量上升，植物通過(guò)增強(qiáng)SOD等抗氧化酶活性，可在一定程度上清除過(guò)多的有害物質(zhì)，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，進(jìn)而保護(hù)葉片光合系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[26]，本研究中的葡萄SOD活性受高溫誘導(dǎo)增多，但不同品種表現(xiàn)不一致。并且，高溫逆境下‘申豐’‘滬培1號(hào)’‘醉金香’3個(gè)品種的MDA含量顯著增加，這與酶蛋白失去活性有關(guān)[27]。由上可知，高溫脅迫下SOD活性和MDA含量的變化與品種的耐熱差異性有關(guān)[28]。

高溫逆境會(huì)傷害植物的光合機(jī)構(gòu)，降低植物的PSII光化學(xué)效率[29-30]。本研究表明，35 ℃高溫處理下‘巨峰’的PIABS、FvFm(ΦPo)、ΨEo和ΦEo有所增加，其他葡萄品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)均無(wú)明顯變化。Luo等[21]認(rèn)為在35 ℃和38 ℃處理下，‘京秀’葡萄的PSII光化學(xué)效率均與對(duì)照處理沒(méi)有顯著性差異[21]。推斷在40 ℃處理下，一些葡萄品種可通過(guò)自身的耗散機(jī)制來(lái)消耗過(guò)剩能量[31]，不對(duì)葡萄葉片的光合原初反應(yīng)造成影響。但是，45 ℃處理3 h即可明顯影響葡萄葉片的光化學(xué)反應(yīng)PSII活性。葡萄、柑橘、甜椒等植物受到高溫脅迫后FvFm會(huì)顯著下降[32-34]，與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，‘申華’‘夏黑’‘巨峰’和‘巨玫瑰’的ΦPo、ΨEo、ΦEo和PIABS值降幅水平顯著低于其他品種，說(shuō)明這4個(gè)品種的PS II受逆境影響較小。不同葡萄品種葉片PS II的供體側(cè)指標(biāo)Wk、受體側(cè)指標(biāo)δRo及反應(yīng)中心指標(biāo)RCQA在45 ℃處理3 h時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異說(shuō)明PS II的供體側(cè)和受體側(cè)發(fā)生能量和電子轉(zhuǎn)移的紊亂，導(dǎo)致反應(yīng)中心中用于激活PS II化學(xué)反應(yīng)的能量減少。對(duì)‘左優(yōu)紅’和‘京秀’葡萄的研究也有相同報(bào)道[21,25]?！曦S’‘滬培1號(hào)’和‘醉金香’的Wk、δRo和RCQA值變化幅度較其他品種更為顯著，說(shuō)明這3個(gè)品種的PS II光化學(xué)反應(yīng)對(duì)高溫更為敏感，光合系統(tǒng)受到的破壞更大。

此外，‘夏黑’和‘申華’在45 ℃處理150 h后葉綠素?zé)晒鈪?shù)值和抗氧化酶活性均恢復(fù)到正常水平值，這可能與植株的耐熱潛能被激發(fā)有關(guān)，所以這2個(gè)品種表現(xiàn)出較強(qiáng)的高溫耐性。

Zha等[35]認(rèn)為HSP21與高溫逆境是存在正比關(guān)系的，sHSPs蛋白參與植物葉片的PS II反應(yīng)，能有效地提高植物的耐熱性[36-37]，在高溫脅迫中上調(diào)表達(dá)可能有利于保護(hù)植物葉片功能。本研究中高溫處理下‘申華’和‘巨峰’品種的HSP21蛋白水平增多，時(shí)間上表現(xiàn)出緩慢積累性和持續(xù)性?！暮凇汀廾倒濉腍SP21蛋白水平在45 ℃高溫處理后表現(xiàn)為先增加后降低，‘滬培1號(hào)’‘醉金香’和‘申豐’的HSP21蛋白在45 ℃高溫處理3 h時(shí)降低，說(shuō)明高溫處理下葉片失水嚴(yán)重，對(duì)蛋白積累也造成影響，所以不同品種應(yīng)答高溫逆境是存在差異的，這些差異可能源于品種間不同的遺傳背景。

綜上可知，高溫脅迫會(huì)破壞葡萄葉片的光化學(xué)反應(yīng)和氧化還原平衡，不同鮮食葡萄品種均發(fā)生不同程度高溫逆境應(yīng)答反應(yīng)。從植株的生長(zhǎng)狀態(tài)、抗氧化酶活性、PS II活性等指標(biāo)變化來(lái)看，7個(gè)品種對(duì)高溫逆境應(yīng)答反應(yīng)的穩(wěn)定性較好的為‘申華’和‘夏黑’，其次是‘巨峰’和‘巨玫瑰’，‘滬培1號(hào)’‘申豐’和‘醉金香’較差。