帥天姣　代海燕　張召弟

[摘要]目的 觀察β-欖香烯對(duì)鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）導(dǎo)致增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平的表達(dá)，探討其對(duì)增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜的可能作用機(jī)制。方法 選取80只Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、STZ誘導(dǎo)成功的糖尿病模型組（DC組）、低劑量β-欖香烯給藥組（BL組）與高劑量給藥組（BH），各20只。給藥組分別在手術(shù)顯微鏡下玻璃體腔內(nèi)注射不同計(jì)量的β-欖香烯、蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠視網(wǎng)膜組織的病理學(xué)改變，取各實(shí)驗(yàn)分組中的視網(wǎng)膜切片，對(duì)VEGF采用免疫組織化學(xué)染色法，檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中VEGF的表達(dá)。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，NC組視網(wǎng)膜各組織結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清晰的層次，DC組較NC組視網(wǎng)膜變薄，且結(jié)構(gòu)破壞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)減少；BL組較DC組略有提高；BH組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較BL組有好轉(zhuǎn)。免疫組織化學(xué)染色后，檢測(cè)的各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜結(jié)果顯示，DC組、NC組、BL組、BH組大鼠VEGF陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)目分別為（125.4671±8.4561）、（10.1324±2.0334）、（75.5123±7.6507）、（21.5364±1.7861）個(gè)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 β-欖香烯可能成為治療增殖期糖尿病性視網(wǎng)膜病變的新作用靶點(diǎn)，同時(shí)可以改善晚期糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，延緩視網(wǎng)膜組織的進(jìn)一步惡化。

[關(guān)鍵詞]β-欖香烯；增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；鏈脲佐菌素

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）6（c）-0007-04

[Abstract]Objective To observe the effect of β-elemene on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in the retina of rats with proliferative diabetic retinopathy caused by streptozocin （STZ），to investigate its possible mechanism of action on retinopathy of rats with proliferative diabetic retinopathy.Methods A total of 80 Wistar rats were selected.They were randomly divided into normal control group （NC group），STZ-induced diabetes model group （DC group），low-dose β-elemene group （BL group） and high-dose group （BH group），20 rats in each group.In the administration group，different doses of β-elemene and hematoxylin-eosin staining were injected into the vitreous cavity under the surgical microscope respectively.The pathological changes of rat retina tissues were observed.Retinal slices from each experiment group were collected.Immunohistochemical staining was applied to VEGF，and the expression of VEGF in retinal tissues was detected.Results The results of HE staining showed that the tissue structure of the retina in the NC group showed a clear level.The retina was thinner in DC group than that in the NC group，and the structure was broken.The number of ganglion cells was reduced；the BL group had a slight increase compared with the DC group.The retinal structure in the BH group was better than that in the BL group.After immunohistochemical staining，the retinal results in each experimental group showed that the number of VEGF-positive nuclei in the DC group，NC group，BL group and BH group was （125.4671±8.4561），（10.1324±2.0334），（75.5123±7.6507），（21.5364±1.7861） respectively，differences between the groups were statistically significant （P<0.05）.Conclusion β-elemene may become a new target for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.At the same time，it can improve the development of advanced DR and delay the further deterioration of retinal tissue.

[Key words]β-elemene；Proliferative diabetic retinopathy；Vascular endothelial growth factor；Streptozotocin

我國(guó)糖尿病患病率日益增加，糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是眼部的一種嚴(yán)重并發(fā)癥[1]，可導(dǎo)致不可逆性的失明。β-欖香烯目前已在糖尿病腎病中被廣泛研究并應(yīng)用，但其對(duì)DR增殖期的影響國(guó)內(nèi)外罕有研究涉及于此，且其對(duì)DR大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的干預(yù)作用，研究者也罕有報(bào)道[2]。本研究主要通過(guò)觀察β-欖香烯對(duì)鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）致DR大鼠增殖期視網(wǎng)膜中VEGF的干預(yù)影響，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGF的表達(dá)，從而進(jìn)一步研究β-欖香烯對(duì)DR的整個(gè)疾病過(guò)程的進(jìn)展和機(jī)制，以便日后在臨床治療中提供更科學(xué)的依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取80只清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄各一半，2個(gè)月齡，體重為160～200 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑

β-欖香烯（沈陽(yáng)萬(wàn)愛(ài)普醫(yī)藥有限公司）；STZ（美國(guó) Sigma公司）；VEGF一抗（武漢博士德生物有限公司）；血糖儀及血糖試紙（德國(guó)羅氏公司）。

1.3 DR大鼠的模型建立以及實(shí)驗(yàn)具體分組

選取實(shí)驗(yàn)級(jí)Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病大鼠模型組（DC組）、低劑量實(shí)驗(yàn)組（BL組）、高劑量實(shí)驗(yàn)組（BH），每組均為20只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，DR組、BL組和BH組在進(jìn)食8 h后，一次性腹腔注射STZ（溶于新鮮配制的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.5）60 mg/kg，NC組以等量的枸櫞酸緩沖液，同樣一次性進(jìn)行腹腔注射。注射后的72 h，采大鼠的鼠尾靜脈血液，來(lái)獲取其空腹的血糖數(shù)值，空腹血糖數(shù)值≥16.7 mmol/L，糖尿病性大鼠的模型就視為建立成功。自糖尿病模型建成后，每天固定時(shí)間段內(nèi)，用高脂高糖飲食飼養(yǎng)DC組、BL組及BH組大鼠，NC組給予含0.02 ml/ml DMSO的生理鹽水灌胃，持續(xù)進(jìn)行16周。16周末次給藥后BL組及BH組大鼠進(jìn)行腹腔注射100 g/L水合氯醛0.01～0.02 ml，用以麻醉。所有實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔麻醉后，雙眼均用復(fù)方托品卡胺滴眼液散瞳，之后玻璃體腔內(nèi)分別注射1、3 μl計(jì)量的β-欖香烯，繼續(xù)飼養(yǎng)2周。

1.4取材處理

腹腔藥物注射14 d后，將所有實(shí)驗(yàn)大鼠處死[3]，采用石蠟將其組織包埋，而后對(duì)所有大鼠的視網(wǎng)膜的石蠟?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行切片[4]，用來(lái)行免疫組織化學(xué)染色和組織病理學(xué)染色，之后利用光學(xué)顯微鏡對(duì)各組織病理學(xué)的變化進(jìn)行觀察，同時(shí)觀察視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的表達(dá)程度[5]。

1.5指標(biāo)測(cè)定

大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱矍蚪萦?0 g/L多聚甲醛溶液中24 h，制成厚度為4 μm的視網(wǎng)膜組織切片，并用蘇木精-伊紅染色后，取光學(xué)顯微鏡對(duì)每組大鼠的視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化進(jìn)行觀察。依照DAB和SP顯色試劑盒操作方法，對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及DAB顯色，再進(jìn)行復(fù)染。最終，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察VEGF蛋白的表達(dá)情況[6]。在觀察的顯微鏡下，如在視網(wǎng)膜細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者，則計(jì)為陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)于每張視網(wǎng)膜組織的石蠟切片，在陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域內(nèi)，再隨機(jī)選擇5個(gè)無(wú)重疊的高倍視野區(qū)來(lái)平均計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜中陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1組織病理學(xué)檢測(cè)

HE染色結(jié)果顯示，NC組大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞排列緊密且規(guī)則，各層組織結(jié)果清晰分明（圖1）；DC組大鼠的視網(wǎng)膜與NC組大鼠視網(wǎng)膜相比較薄，且神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列呈現(xiàn)不規(guī)則趨勢(shì)并發(fā)生水腫，內(nèi)界膜還可看到有不同程度的斷裂情況（圖2）；BL組與DC組相比略有改善（圖3）；BH組的視網(wǎng)膜各組織結(jié)構(gòu)基本正常，與DC組相比明顯改善（圖4）。

2.2免疫組織化學(xué)染色

NC組大鼠只在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)到棕黃色或黃色顆粒，VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)為（10.1324±2.0334）個(gè)（圖5）；DC組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)外核層、內(nèi)核層及細(xì)胞層細(xì)胞核內(nèi)均可見(jiàn)到棕黃色或黃色顆粒，VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)為（125.4671±8.4561）個(gè)，與NC組相比較明顯增加（圖6）；BL組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)內(nèi)核層、細(xì)胞層細(xì)胞核內(nèi)可觀察到棕黃色或黃色顆粒，VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)為（75.5123±7.6507）個(gè)，較DC組有所改善（圖7）；BH組大鼠VEGF蛋白內(nèi)核層可見(jiàn)極少量的棕黃色或黃色顆粒，其主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)為（21.5364±1.7861）個(gè)，與DC組、BL組相比明顯減少；各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖8）。

3討論

DR是糖尿病并發(fā)癥的常見(jiàn)疾病之一，也是眼部最為常見(jiàn)、最為嚴(yán)重的微血管疾病之一[7]。DR先是視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞的死亡，逐步發(fā)展為視網(wǎng)膜形成大片新生血管，最終牽拉導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，視力喪失[8]。目前，多數(shù)研究者認(rèn)為，視網(wǎng)膜細(xì)胞在高糖及缺氧的環(huán)境中進(jìn)行過(guò)度、過(guò)多的氧化應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜周細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損[8]。其中，凋亡又是DR發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[9]。視網(wǎng)膜組織的缺血、缺氧狀態(tài)又同時(shí)導(dǎo)致視網(wǎng)膜基底膜增厚，毛細(xì)血管的管腔又因內(nèi)皮細(xì)胞的水腫而變窄，甚至最終導(dǎo)致血管閉塞，而使血-視網(wǎng)膜屏障遭到破壞[10]。糖尿病病程越長(zhǎng)，血-視網(wǎng)膜屏障破壞越嚴(yán)重[11]，視網(wǎng)膜缺血、缺氧的范圍就越廣泛。視網(wǎng)膜新生血管向玻璃體內(nèi)不停地破裂延伸，使得玻璃體積血，隨著病程的發(fā)展，最后引起牽引性的視網(wǎng)膜脫離[12]。

β-欖香烯為我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥單體[13]，具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化、保護(hù)心血管及降血脂等重要藥理作用，目前已被應(yīng)用于糖尿病腎病的治療中，但其對(duì)DR增殖期的影響國(guó)內(nèi)罕有研究涉及于此[3]。

VEGF是針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有較高特異性的促有絲分裂原[14]，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖方面起到關(guān)鍵作用，同時(shí)又可以增加血管的通透性。當(dāng)視網(wǎng)膜組織處于高糖環(huán)境或缺氧環(huán)境下，視網(wǎng)膜VEGF的含量升高，使其表達(dá)過(guò)度[15]，從而引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞，形成無(wú)灌注[16]，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡，造成視網(wǎng)膜局部缺血，導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障損傷。β-欖香烯可以通過(guò)抑制VEGF引起的新生血管[17]達(dá)到抑制DR發(fā)展的作用。

綜上所述，β-欖香烯可能成為治療增殖期DR的新作用靶點(diǎn)，同時(shí)可以改善晚期DR的發(fā)展，延緩視網(wǎng)膜組織的進(jìn)一步病變，對(duì)于治療增殖期DR的藥物選擇提供了一個(gè)新的思路。

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（收稿日期：2018-03-05 本文編輯：祁海文）