吳建偉　黃建栩　鄭榮

[摘要]目的 研究中藥砷復(fù)合制劑青黃散（由青黛和雄黃二藥組成）組分靛玉紅（Indirubin，青黛的有效成分）和二硫化二砷（Arsenic Disulfide，As2S2，雄黃的有效成分）對(duì)非M3型急性髓系白血?。ˋML）KG1a細(xì)胞株的單獨(dú)和聯(lián)合殺傷作用，并探討相關(guān)殺傷作用機(jī)制。方法 采用瑞氏姬姆沙染色法觀察靛玉紅與As2S2作用于KG1a細(xì)胞的形態(tài)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靛玉紅與As2S2作用于KG1a細(xì)胞凋亡率，采用CCK-8檢測(cè)靛玉紅與As2S2作用于KG1a細(xì)胞抑制率，進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)KG1a細(xì)胞Bcl-2、Smac、XIAP-1、c-IAP、Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 青黃散組分靛玉紅與As2S2單獨(dú)對(duì)KG1a細(xì)胞均具有增殖抑制作用，聯(lián)合用藥的增殖抑制率、凋亡率作用更明顯（P<0.05），CompuSyn軟件分析靛玉紅和As2S2以1∶1組合對(duì)KG1a細(xì)胞株的聯(lián)合指數(shù)（CI）<0.9。聯(lián)合用藥在形態(tài)學(xué)上能明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡變化，增加細(xì)胞的Caspase-3和Smac蛋白表達(dá)，抑制BCL-2、XIAP-1、c-IAP蛋白的表達(dá)。結(jié)論 青黃散組分靛玉紅與As2S2能聯(lián)合抑制KG1a細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制與抑制BCL-2、XIAP-1、c-IAP蛋白表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3、Smac蛋白表達(dá)相關(guān)。本藥可用于治療常規(guī)藥物抵抗的AML并為非M3型AML的治療提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]青黃散；KG1a；二硫化二砷；靛玉紅；凋亡

[中圖分類號(hào)] R33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）6（c）-0010-07

[Abstract]Objective To study the effects of Qinghuang Powder （composed of two components of Indigo naturalis and Realgar），which the active ingredients are Indirubin and Arsenic Disulfide （As2S2），alone and in combination with cytotoxic effect on non M3 AML KG1a cells，and to investigate the mechanism of cytotoxic effect.Methods The cell morphology of KG1a cells acted on with Indirubin and As2S2 was observed by Wright Gimsa staining；the rate of cell apoptosis of KG1a cells acted on with Indirubin and As2S2 was detected by flow cytometry；CCK-8 detected for apoptosis rate of KG1a cells acted on with Indirubin and As2S2；the expression of Bcl-2，Smac，XIAP-1，c-IAP，Caspase-3 protein of KG1a cells was detected by Western blot.Results Both Indirubin and As2S2 had inhibitory effect on proliferation of KG1a cells.Compare with single dose，the combination of Indirubin and As2S2 had a higher cell proliferation inhibition rate and apoptosis rate（P<0.05）.When Indirubin and As2S2 combined with 1∶1，the combined index was less than 0.9 through CompuSyn，which could also influenced the apoptosis highly，increased the expression of Caspase-3 and Smac protein，and inhibit the expression of BCL-2，XIAP-1 and c-IAP protein.Conclusion The Indirubin and As2S2，the ingredient of Qinghuang Powder，can inhibit the proliferation of KG1a cells and induce its apoptosis，the mechanism may be related to inhibition of the expression of BCL-2，XIAP-1，c-IAP protein，promote the expression of Caspase-3，Smac protein.Qinghuang powder can be used for the treatment of AML of conventional drug resistance and provides the relevant experimental basis for the treatment of non-M3 type AML.

[Key words]Qinghuang Powder；KG1a；Arsenic Disulfide；Indirubin；Apoptosis

青黃散全稱青黛雄黃散，始載于元·孫允賢輯《醫(yī)方大成》，屬砷復(fù)合制劑。北京西苑醫(yī)院應(yīng)用其治療包括急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）在內(nèi)的多種惡性血液病已有半個(gè)世紀(jì)的歷史，周靄祥等[1-3]總結(jié)得出青黃散應(yīng)用于血液疾病如骨髓增生異常綜合征等可有效提高緩解率、有效率等[4-5]。我科應(yīng)用青黃散治療AML、骨髓增生異常綜合征、慢性粒細(xì)胞白血病等惡性血液病，亦取得相應(yīng)療效且不良反應(yīng)相對(duì)較小，并觀察到有部分患者療效較佳。

青黃散組分包含靛玉紅[6]（Indirubin，青黛的有效成分）和二硫化二砷（Arsenic Disulfide，As2S2，雄黃的有效成分），基礎(chǔ)研究顯示，靛玉紅（Indirubin）可抑制白血病細(xì)胞增殖[7]，誘導(dǎo)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡[8-9]；As2S2可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，降低端粒酶活性，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-13]。靛玉紅（Indirubin）與As2S2單藥的研究相對(duì)透徹，兩者聯(lián)用的研究相對(duì)較少，且其能否對(duì)難治性AML起作用尚不清楚，白血病的復(fù)發(fā)與難治主要與白血病干細(xì)胞[14]有關(guān)，本研究以屬于白血病干細(xì)胞（leukemic stem cells，LSCs）并抵抗蒽環(huán)類藥物和自然殺傷作用的KG1a細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討單用和聯(lián)用的生物導(dǎo)致藥物相關(guān)分子變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要材料和細(xì)胞株

人類急性髓系白血病KG1a細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科郭坤元教授惠贈(zèng)；靛玉紅（Indirubin，純度95%，10mg）為上海阿拉丁公司產(chǎn)品；As2S2[Arsenic（Ⅱ） sulfide，tech.90%，5 g]為美國(guó)Alfa Aesar公司產(chǎn)品；IMDM、胎牛血清培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；瑞氏吉姆沙染色劑為BASO公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒為日本同仁株式會(huì)社產(chǎn)品；DMSO、SDS、Tris堿為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Smac抗體、Bcl-2抗體、XIAP-1抗體、c-IAP抗體、Caspase-3抗體、β-actin抗體以及兔抗鼠抗體為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；X曝光片為日本富士公司產(chǎn)品；Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑為美國(guó)Genes公司產(chǎn)品。

1.2主要設(shè)備儀器

YG-875B超凈工作臺(tái)（蘇州醫(yī)療設(shè)備廠），電子天平AB-160型（美國(guó)Denver公司），酸度計(jì)pHS-25型（上海雷磁儀器廠），磁力攪拌器75-2型（上海市醫(yī)用分析儀器廠），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司），F(xiàn)ACSCalibur TMBD型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Courful公司），酶標(biāo)儀Elx800（美國(guó)Bio-Tek instruments），Olympus BH-2倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），微型電泳及電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 KG1a細(xì)胞的培養(yǎng)

KC1a細(xì)胞株培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%青霉素、1%鏈霉素）中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次（半量換液或離心全量換液），密切觀察細(xì)胞污染情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 10 mmol/L As2S2溶液的配制

稱量2.14 g As2S2，溶解于500 ml的1 mol/L的NaOH溶液中，磁力攪拌器連續(xù)攪拌72 h，使用酸度計(jì)將以上溶液用1 mol/L的HCl溶液調(diào)整pH值7.35～7.45，0.22 μmol濾器過濾后即為As2S2母液，用無菌EP管分裝，于4℃冰箱保存。使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.5 10 mmol/L Indirubin溶液的配制

稱量10 mg Indirubin，溶解于3.81 ml的DMSO中，用0.22 μmol濾器過濾后產(chǎn)生Indirubin母液，用無菌EP管分裝后避光保管于-80℃冰箱。使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.6細(xì)胞生長(zhǎng)活力的檢測(cè)

將1×104/ml的KG1a細(xì)胞接種到96孔板中，每孔總體積100 μl，實(shí)驗(yàn)分空白Control組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組以及As2S2（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）和Indirubin（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）處理組，每組5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，在每孔加入10 μl CCK-8液后，于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，輕輕震蕩混勻后直接在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=[1-（藥物處理孔OD-空白對(duì)照孔OD）/（實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔OD-空白對(duì)照孔OD）]×100%。

1.7瑞氏染色法觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KG1a細(xì)胞，以5×105/ml的密度接種到12孔板中，實(shí)驗(yàn)分10組，分別為不加藥物處理的Control組，10、50、100 μmol/L的As2S2處理組，10、50、100 μmol/L的Indirubin處理組，10 μmol/L As2S2+10 μmol/L Indirubin處理組，50 μmol/L As2S2+50 μmol/L Indirubin處理組，100 μmol/L As2S2+100 μmol/L Indirubin處理組。每組3個(gè)復(fù)孔，處理48 h后以1000 r/min離心5 min收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞，PBS重懸洗滌細(xì)胞1次后取一部分細(xì)胞用10 μl的胎牛細(xì)胞重懸，再迅速涂片到玻片上，室溫下晾干后用瑞氏染色液滴于玻片上，再滴同樣體積的去離子水，混勻，室溫下染色5～10 min，沖洗染好的玻片并在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分10個(gè)組，分別為不加藥物處理的Control組，10、50、100 μmol/L的As2S2處理組，10、50、100 μmol/L的Indirubin處理組，10 μmol/L As2S2+10 μmol/L Indirubin處理組，50 μmol/L As2S2+50 μmol/L Indirubin處理組，100 μmol/L As2S2+100 μmol/L Indirubin處理組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后以1000 r/min離心5 min收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KG1a細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，1000 r/min離心5 min，再加入500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，接著加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后，再加入5 μl PI混勻，在室溫下、避光5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白

收集根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組作用48 h后的KG1a細(xì)胞，加入蛋白裂解液在冰上裂解收集上清液；再進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉后加入相應(yīng)的單抗孵育2 h，PBS洗滌牛奶封閉的膜條3遍，之后結(jié)合HRP-二抗，用于檢測(cè)β-actin、BCL-2、XIAP-1、c-IAP、Caspase-3、Smac蛋白表達(dá)；最后化學(xué)發(fā)光顯影、掃描分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中所有需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)都設(shè)置了至少3個(gè)復(fù)孔并實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，細(xì)胞凋亡采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間多重比較采用LSD法；方差不齊時(shí)，組間多重比較采用Dunnett′s T3法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合藥物的協(xié)同作用應(yīng)用CompuSyn軟件進(jìn)行分析，聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）<0.9表示協(xié)同作用，0.9≤CI≤1.1為疊加作用，CI>1.1表示拮抗作用。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞毒作用

2.1.1 Indirubin 對(duì)KG1a細(xì)胞的增殖抑制作用 KG1a細(xì)胞經(jīng)Indirubin（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）分別處理24、48、72、96 h后（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍），上述濃度處理KG1a細(xì)胞24 h和48 h后，細(xì)胞抑制率較Control組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且隨濃度上升，細(xì)胞抑制率無明顯變化；上述濃度處理72 h和96 h后，細(xì)胞抑制率與Control組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但隨濃度升高，細(xì)胞抑制率無明顯變化；KG1a細(xì)胞經(jīng)相同濃度Indirubin處理24、48 h后，細(xì)胞抑制率與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），經(jīng)相同濃度Indirubin處理72、96 h后，細(xì)胞抑制率與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；相同濃度Indirubin處理KG1a細(xì)胞24 h和處理72、96 h比較，細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），相同濃度Indirubin處理KG1a細(xì)胞48 h和處理72、96 h比較，細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.1.2 As2S2對(duì)KG1a細(xì)胞的增殖抑制作用 KG1a細(xì)胞經(jīng)As2S2（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）分別處理24、48、72、96 h后（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍），上述濃度處理KG1a細(xì)胞24、48、72、96 h后，細(xì)胞抑制率較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；As2S2在0.01～100.00 μmol/L處理KG1a細(xì)胞24 h和48 h，隨著濃度增加，細(xì)胞抑制率變化不明顯；在1000.00 μmol/L處理KG1a細(xì)胞24 h和48 h，細(xì)胞抑制作用較0.01～100.00 μmol/L明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；As2S2在0.01～1.00 μmol/L之間處理KG1a細(xì)胞72 h和96 h，隨著濃度增加，細(xì)胞抑制率變化不明顯；在10.00～1000 μmol/L之間，隨著濃度增加，細(xì)胞抑制率增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低濃度（0.01～1.00 μmol/L）作用KG1a細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制作用不明顯，高濃度（10.00～1000.00 μmol/L）作用KG1a細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制作用明顯，抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.1.3 As2S2聯(lián)合Indirubin對(duì)KG1α細(xì)胞的增殖抑制作用 根據(jù)As2S2、Indirubin單藥對(duì)KG1a細(xì)胞的增殖抑制作用，利用SPSS 20.0計(jì)算出As2S2各試驗(yàn)時(shí)間段CI50為1～1000 μmol/L，且Indirubin對(duì)KG1a細(xì)胞的增殖抑制作用具有時(shí)間依賴性，選擇As2S2低、中、高三個(gè)濃度（10、50、100 μmol/L）單藥及分別聯(lián)合Indirubin低、中、高三個(gè)濃度（10、50、100 μmol/L），共作用于KG1a細(xì)胞株48 h，采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍），結(jié)果顯示，三組As2S2單藥及三組As2S2分別聯(lián)合Indirubin三個(gè)濃度（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L）的細(xì)胞抑制率均較Control組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低濃度As2S2與低、中、高濃度Indirubin組合后，A、B、C、D各組細(xì)胞存活率分別為（0.150±0.033）%、（0.195±0.119）%、（0.178±0.055）%、（0.203±0.040）%，A、B、C、D各組的細(xì)胞抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中濃度As2S2與低、中、高濃度Indirubin組合后，E、F、G、H各組細(xì)胞抑制率分別為（0.215±0.034）%、（0.256±0.108）%、（0.557±0.045）%、（0.628±0.080）%，E和F的細(xì)胞抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），E和G、H的細(xì)胞抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），中濃度As2S2聯(lián)合不同濃度Indirubin的細(xì)胞抑制率有差異，其中F和G、F和H之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；高濃度As2S2與低、中、高濃度Indirubin組合后，I、J、K、L各組細(xì)胞抑制率分別為（0.456±0.093）%、（0.675±0.123）%、（0.754±0.056）%、（0.777±0.039）%，I和J、K、L的細(xì)胞抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3）。通過CompuSyn軟件分析As2S2和Indirubin以1︰1組合對(duì)KG1a細(xì)胞株的CI，10 μmol/L As2S2+10 μmol/L Indirubin的CI值為0.40，50 μmol/L As2S2+50 μmol/L Indirubin的CI值為0.25，100 μmol/L As2S2+100 μmol/L Indirubin的CI值為0.15，兩藥經(jīng)1︰1聯(lián)合處理后的CI值均<0.9，提示As2S2和Indirubin具有協(xié)同作用。

2.2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化

通過瑞氏吉姆薩染色觀察As2S2、Indirubin單藥及兩藥聯(lián)合對(duì)KG1a細(xì)胞株作用48 h后細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。Control組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞呈圓形或類圓形，表面光滑，染色質(zhì)疏松、胞質(zhì)少。Indirubin低、中、高濃度（10、50、100 μmol/L）單藥處理KG1a細(xì)胞株作用48 h后，細(xì)胞形態(tài)變化不大，大致類圓形，但部分細(xì)胞胞質(zhì)可見少量空泡（箭頭所示）；As2S2低、中、高濃度（10、50、100 μmol/L）單藥處理KG1a細(xì)胞株作用48 h后，細(xì)胞形態(tài)隨As2S2濃度增加而不規(guī)則，部分細(xì)胞邊緣不齊、腫脹，伴細(xì)胞質(zhì)空泡形成、細(xì)胞核固縮（箭頭所示）；As2S2低、中、高濃度分別聯(lián)合Indirubin低、中、高濃度對(duì)KG1a細(xì)胞株作用48 h后，細(xì)胞形態(tài)隨聯(lián)合藥物濃度增加而不規(guī)則，大部分細(xì)胞邊緣不齊，細(xì)胞空泡化隨聯(lián)合藥物濃度增加，染色質(zhì)固縮隨聯(lián)合藥物濃度增加而增加（箭頭所示）（圖4）。聯(lián)合藥物組對(duì)KG1a細(xì)胞株作用后細(xì)胞凋亡形態(tài)對(duì)比Control組及As2S2、Indirubin單藥組更加明顯。

2.3流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化

通過流式細(xì)胞儀，進(jìn)一步驗(yàn)證As2S2、Indirubin單藥及As2S2聯(lián)合Indirubin對(duì)KG1a細(xì)胞株作用48 h后的細(xì)胞總凋亡率的變化。結(jié)果顯示，As2S2，Indirubin各低、中、高單藥組及As2S2低、中、高濃度對(duì)應(yīng)聯(lián)合Indirubin低、中、高濃度作用于KG1a細(xì)胞株作用48 h后的細(xì)胞總凋亡率均較Control組升高，低濃度Indirubin（A）和中濃度Indirubin（D）的KG1a細(xì)胞總凋亡率與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余單藥濃度（B、E、G、H）和聯(lián)合藥物（C、F、I）的KG1a細(xì)胞總凋亡率與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；低、中、高濃度As2S2對(duì)應(yīng)聯(lián)合低、中、高濃度Indirubin的KG1a細(xì)胞總凋亡率分別為（68.47±0.85）%、（77.63±0.74）%、（81.53±0.86）%，均較低、中、高濃度As2S2和低、中、高濃度Indirubin的KG1a細(xì)胞總凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖5）。

2.4免疫印跡分析相關(guān)凋亡蛋白的影響

為研究As2S2聯(lián)合Indirubin的相關(guān)凋亡機(jī)制，利用Western blot探究50 μmol/L As2S2單藥、50 μmol/L Indirubin單藥和兩者聯(lián)合對(duì)KG1a細(xì)胞株作用48 h后的細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，各組β-actin蛋白表達(dá)無明顯差異；Indirubin單藥對(duì)KG1a的促凋亡蛋白Caspase-3和Smac表達(dá)較對(duì)照組上升，抑凋亡蛋白BCL-2、XIAP-1、c-IAP與對(duì)照組基本一致；As2S2單藥對(duì)KG1a的促凋亡蛋白Caspase-3和Smac表達(dá)較對(duì)照組和Indirubin單藥上升，抑凋亡蛋白BCL-2、XIAP-1、c-IAP較對(duì)照組下降；兩藥聯(lián)合后，KG1a的促凋亡蛋白Caspase-3和Smac表達(dá)較對(duì)照組和單藥組明顯上升，抑凋亡蛋白BCL-2、XIAP-1、c-IAP較對(duì)照組和單藥組明顯下降（圖6），提示As2S2聯(lián)合Indirubin能上調(diào)KG1a的促凋亡蛋白表達(dá)，下調(diào)KG1a的抑凋亡蛋白表達(dá)（該步實(shí)驗(yàn)結(jié)果未行熒光灰度掃描）。

3討論

青黃散全稱青黛雄黃散，始載于元·孫允賢輯《醫(yī)方大成》，文中記載“諸凡始覺中毒、及蛇蟲咬、癰疽才作”，即取青黛、雄黃等分，研為細(xì)末，取新汲水調(diào)服二錢，可“令毒瓦斯不聚”；至明·董宿著《奇效良方》中，文中亦載“凡始覺中毒，意思不快，胸腹臟悶，即服此藥，毒瓦斯不聚”的相關(guān)條文。方中青黛性寒，味咸，主入肝經(jīng)，歷代文獻(xiàn)如《開寶本草》《本經(jīng)逢原》等均謂其可除熱解毒，兼能涼血，用治溫毒發(fā)斑，具有消腫散瘀、涼血解毒之效；雄黃性溫，味辛，歸肝、大腸經(jīng)，首以“黃食石”之名始于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代文獻(xiàn)如《藥性論》《本草綱目》等均言其乃治瘡殺毒要藥，尤重描述雄黃的純陽之性與化瘀之效，具有可消積聚，解百毒，化腹中之瘀血之功。青黛、雄黃兩者一寒一溫相須而用，青黛配雄黃，借雄黃之陽熱可防青黛苦寒?dāng)∥?；雄黃配青黛，借青黛入血分之效引雄黃入骨髓以增強(qiáng)雄黃殺髓毒之功，又能除雄黃溫?zé)嶂?，兩者?lián)用，可奏溫扶元陽、解毒化瘀之功效，與扶正祛邪的思想相合。目前，有研究顯示，應(yīng)用青黃散于血液病能夠取得一定療效[15-16]。我科前期研究發(fā)現(xiàn)砷制劑如三氧化二砷對(duì)KG1a細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用[17]，也有青黃散臨床應(yīng)用于AML、骨髓增生異常綜合征、慢性粒細(xì)胞白血病等惡性血液病經(jīng)驗(yàn)，并取得一定療效。

KG1a細(xì)胞株與白血病干細(xì)胞免疫表型相一致，細(xì)胞膜表面表達(dá)CD34+和CD123+，包含有（54.167±6.57）% CD34+CD38-細(xì)胞，是目前公認(rèn)的白血病干細(xì)胞株。研究顯示，KG1a細(xì)胞表現(xiàn)出了干細(xì)胞特性的無限增殖、自我更新能力[18-21]。為初步探究青黃散對(duì)白血病干細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究選用KG1a細(xì)胞株為研究對(duì)象，應(yīng)用青黃散組分Indirubin和As2S2分別及聯(lián)合作用于白血病干細(xì)胞株KG1a，觀察其作用于KG1a細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞凋亡程度及凋亡蛋白變化。

細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)顯示，Indirubin對(duì)KG1a細(xì)胞株連續(xù)作用72 h以上具有增殖抑制作用，不具有濃度依賴性，提示提高Indirubin濃度不能提高增殖抑制作用，且連續(xù)作用72 h后增殖抑制作用明顯提高；As2S2對(duì)KG1a細(xì)胞具有增殖抑制作用，呈時(shí)間-濃度依賴性，提示As2S2的劑量越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng)；說明Indirubin和As2S2均能不同程度抑制KG1a細(xì)胞的增殖。

單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥相比較，根據(jù)元·孫允賢輯《醫(yī)方大成》，將Indirubin和As2S2以1︰1的不同濃度配合作用于KG1a細(xì)胞48 h后觀察其相關(guān)指標(biāo)變化。兩藥聯(lián)合的細(xì)胞抑制率均較Control組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩藥經(jīng)1︰1聯(lián)合處理后的CI值均<0.9，提示As2S2和Indirubin具有協(xié)同作用。同時(shí)，在細(xì)胞凋亡形態(tài)方面，與單藥相比，As2S2聯(lián)合Indirubin對(duì)KG1a細(xì)胞株作用48 h后，細(xì)胞形態(tài)隨聯(lián)合藥物濃度增加而不規(guī)則，大部分細(xì)胞邊緣不齊，細(xì)胞空泡化隨聯(lián)合藥物濃度增加，染色質(zhì)固縮隨聯(lián)合藥物濃度增加而增加，提示兩種藥物聯(lián)合可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡?；罴?xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞凋亡不同階段所表達(dá)的不同特征檢測(cè)細(xì)胞凋亡階段的發(fā)生。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Indirubin單藥對(duì)于KG1a細(xì)胞株的促凋亡作用不明顯，As2S2單藥主要促進(jìn)KG1a細(xì)胞株發(fā)生晚期凋亡，兩藥聯(lián)合促進(jìn)KG1a細(xì)胞的發(fā)生早期凋亡，從而提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率。研究顯示，磷脂酰絲氨酸外翻機(jī)制主要與細(xì)胞內(nèi)ATP缺乏、胞漿Ca2+濃度升高、活性氧濃度過高、腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞因子的激活或物理性損傷等有關(guān)[22]。As2S2聯(lián)合Indirubin后明顯促進(jìn)磷脂酰絲氨酸外翻，可推知其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或許與促進(jìn)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、影響胞內(nèi)ATP的合成、促進(jìn)活性氧內(nèi)流等有關(guān)。凋亡蛋白方面，通過Western blot發(fā)現(xiàn)As2S2聯(lián)合Indirubin作用KG1a細(xì)胞48 h后，兩藥聯(lián)用可顯著提高促凋亡蛋白（Caspase-3和Smac）表達(dá)，明顯下調(diào)抑凋亡蛋白（BCL-2、XIAP-1、c-IAP）表達(dá)。Smac的表達(dá)提高，可特異性地結(jié)合IAPs對(duì)下游效應(yīng)Caspase的抑制[23-25]，具體表現(xiàn)為Smac提高，特異性結(jié)合IAPs，使XIAP和c-IAP表達(dá)下調(diào)，引起下游Caspase-3表達(dá)提高當(dāng)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，磷脂酰絲氨酸外翻時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)Caspase的活化，可見總體Caspase-3表達(dá)增多，同時(shí)BCL-2表達(dá)下調(diào)，總體促凋亡蛋白表達(dá)增多、抑凋亡蛋白表達(dá)減少，共同引起細(xì)胞通過線粒體途徑凋亡。

綜上所述，As2S2聯(lián)合Indirubin具有協(xié)同作用，此協(xié)同作用具有濃度依賴性；As2S2聯(lián)合Indirubin對(duì)KG1a細(xì)胞株具有明顯的抑制存活和促凋亡作用；As2S2聯(lián)合Indirubin可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性線粒體途徑凋亡，與促凋亡蛋白（Caspase-3和Smac）表達(dá)上升和抑凋亡蛋白（BCL-2、XIAP-1、c-IAP）表達(dá)下降有關(guān)；As2S2聯(lián)合Indirubin后促凋亡作用提高，為“雄黃與青黛一熱一寒、一陽一陰的配伍，具有溫而不燥、寒而不凝之功，可奏溫扶元陽、鼓舞氣血、攻毒化瘀、消積散聚之效”的中醫(yī)傳統(tǒng)理論提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，為實(shí)驗(yàn)性治療難治/復(fù)發(fā)的AML及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)治療惡性血液病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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