鄒琪琪，齊姍姍，謝錄翰，辛 琪，李俊樂，張夢寧，葛 欣

(河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002)

甲基營養(yǎng)菌(Methylovorus)是一類能夠利用甲醇等一碳碳源生存的微生物，是研究一碳代謝的模式菌，同時，甲基營養(yǎng)型細菌代謝產物非常豐富，是多種重要化合物工業(yè)生產的候選菌株[1]。其代謝產物吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，簡稱PQQ)是繼煙酰胺核苷酸和黃素核苷酸之后發(fā)現的第三類氧化還原酶輔酶，其具有多種生理功能，PQQ具有較強清除氧自由基的作用，能夠刺激動植物生長，防治心腦疾病、肝損傷、促進神經保護等功能[2-4]。

甲醇脫氫酶(methanol dehydrogenase，MDH)MDH是甲基營養(yǎng)菌對甲醇利用和生物氧化的關鍵酶，是一種以PQQ為輔基的醌蛋白，其結構是由2個亞基組成，為α2β2的四聚體。每分子酶含有2分子PQQ和2分子Ca2+，且它們均位于酶活性中心處，在酶的催化反應中起重要作用。在甲基營養(yǎng)菌中，甲醇的氧化是通過甲醇脫氫酶進行的，它催化甲醇氧化成甲醛。甲醇脫氫酶與甲醇及PQQ的結構和催化具有一定的聯系，PQQ的構型變化是由甲醇脫氫酶酶促反應誘導的[5]。有文獻報道，MDH對甲醇活力較低并不是酶本身的原因，而是相應的底物和某些協助因子未能發(fā)揮最佳作用所造成的。李大攀等[6]敲除PQQ依賴的MDH基因后，MDH的活力及氧化甲醇的能力下降，說明對甲醇的利用是多基因協同作用的結果。王冠芳等[7]提純MDH進行活性檢測及對底物催化專一性實驗，發(fā)現依賴PQQ甲醇脫氫酶對底物催化專一性差。李淼鑫等[8]從甲基營養(yǎng)菌中擴增甲醇脫氫酶(MDH)基因，并在大腸埃希菌中表達，檢測其活性，考察該基因對吡咯喹啉醌(PQQ)產生的影響，該基因能夠在大腸埃希菌中表達，且表達產物具有生物活性；提高MDH的表達水平對甲基營養(yǎng)菌PQQ的生物合成有一定影響。甲醇作為某些甲基營養(yǎng)菌株的惟一碳源，對菌體生長和PQQ生物合成的影響較大，甲醇脫氫酶是同化甲醇并為菌體生長提供能量的關鍵酶，醌酶的表達水平對PQQ具有一定影響。本研究利用細菌單雜交技術，篩選與甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp. MP688[9](中國普通微生物菌種保藏中心，編號CGMCC4096)的甲醇脫氫酶啟動子有相互作用的轉錄因子，為闡明甲醇脫氫酶在甲基菌生長和代謝產物合成中的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及引物

本實驗所用的菌株和質粒見表1，引物見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，ddH2O 1 L調節(jié)pH至7.0，用于大腸埃希菌的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃。

表1菌株和質粒

Table1Strains and plasmids

菌株與質粒Strains and plasmids特征Character來源SourceE. coli XL1-BlueΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96relA1 lac[F' proAB lacIq ZΔM15 Tn5(kanr)]本實驗室保藏Laboratory stockpTRGBacterial one-hybrid assay bait domain vector, Tetracycline本實驗室保藏Laboratory stockpROMOTERDetection of protein-DNA interaction, Chloramphenicolr本實驗室保藏Laboratory stockB2H Validation strainΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 hisB supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1 lac[F'lacIq HIS3 aadA Kanr]本實驗室保藏Laboratory stockMethylovorus sp. MP688甲基營養(yǎng)菌Methylotrophic bacteria本實驗室保藏Laboratory stockMethylobacteriumextorquens AM1甲基營養(yǎng)菌模式菌株Model strain of methylotrophic bacteria本實驗室保藏Laboratory stock

表2本研究中使用的引物

Table2Primers used in this study

引物Primers序列Sequences用途UseLuxR1CGGGATCCATGAAAAAAGCGAATGATGGAATTCCTAAATCTTGAGTTTGCTTCTPCR of LuxR1 sequenceLuxR2CGGGATCCATGAGTGAAGAAATTATCCGGCCCTCGAGTCAGCTATCGATCAAGCCATPCR of LuxR2 sequenceLuxR3CGGGATCCATGCAAGGTGCAGTAAGAGCCCTCGAGTCACGTTTTGATGATGTTGPCR of LuxR3 sequenceLuxR4CGGGATCCATGCCTGCAGATAAAAAAAGACTAGTCTAATCGACCAGATTGTTTTTPCR of LuxR4 sequenceLuxR5CGGGATCCATGCGCGATATTTTCATTTCTGGGAATTCTCAGCCCTGTCGATCATTCAGPCR of LuxR5 sequenceLuxR6CGGGATCCATGAAACACATTATTGTCGTGGGGAATTCTTAACGAGGCTGGAAAATATAAPCR of LuxR6 sequenceLuxR7CGGGATCCATGGATTTCACATCTGGCAATGGAATTCCTACCCTTTTCCCAGGTAATCPCR of LuxR7 sequenceLuxR8CGGGATCCATGCGCATACACAATGTCACCCTCGAGTCAGGTATTTAGAAGGCGATPCR of LuxR8 sequenceLuxR9CGGGATCCATGTTTATTACCAAAGAACTAACCCCCTCGAGTCATGAGGCCCGTGGPCR of LuxR9 sequenceLuxR10CGGGATCCATGAGCATCCCCAGTAACCGGAATTCTTACTTTTTACGATGGGCCPCR of LuxR10 sequenceLuxR11CGGGATCCATGAAAAAAATATTATTGGTGGACGGAATTCTCATGTAATCAGGCCGTTCTPCR of LuxR11 sequenceLysR1CGGGATCCATGAATACCTCCCTCACCAGGAATTCCTAGATCAGCAGTTCATCCAPCR of LysR1 sequenceLysR2CGGGATCCATGATCGAAATCCGACATCGGAATTCTCACAGCAAACGTATGCCTPCR of LysR2 sequenceLysR3CGGGATCCATGCCCTCGGTCAAAAGGGAATTCTTAATCGATGGCGGCCPCR of LysR3 sequenceLysR4CGGGATCCATGAAGCTCGACCAACTCAGGAATTCTTAAGCGTCACCTCCCATPCR of LysR4 sequenceLysR5CGGGATCCATGAAGCTGGAAGCCAATGAGGAATTCTTACCGTTTGTGCTTTTCGCPCR of LysR5 sequenceLysR6CGGGATCCATGGATACCCTGCGTAGCAGGAATTCCTAGCGCATTCTCCACTCCPCR of LysR6 sequenceLysR7CGGGATCCATGGCAATGGACAGGTTTGGGAATTCTTATCTGGAAGCGCCATTGPCR of LysR7 sequenceLysR8CGGGATCCATGCGCGTACTGGTAGCCGGAATTCCTAAAGATGGGGATGCGCPCR of LysR8 sequenceLysR9CGGGATCCATGTTTAGAATTAGCCTGGATGCGGAATTCTCAGGGGAAACCTTTACCGPCR of LysR9 sequenceLysR10CGGGATCCATGCATGATCTCAATTTGATGGGGAATTCTCAACGCGCATCCCAATPCR of LysR10 sequenceLysR11CGGGATCCATGAGCTTCAATATTATTTTGAAGGAATTCTTAGCGATAAAGGTAAGTGTTTPCR of LysR11 sequenceTetR1CGGGATCCATGACTGAACAGGAAAAGGAATTCTTACTTGCTTGGCCAATTCAPCR of TetR1 sequenceTetR2CGGGATCCATGGTACGCAAAACCAAAGCCCTCGAGTTATGCGTTTTTGTTCTTTCGPCR of TetR2 sequenceTetR3CGGGATCCATGTCACCCCCCACCCGGAATTCTCATGATGCTTGCTCCCCPCR of TetR3 sequenceTetR4CGGGATCCATGCGCGAATATATTCTGGAGGGAATTCCTAGGGGGCAGATGCTATCAGTAPCR of TetR4 sequenceTetR5CGGGATCCATGGTCAAATCCCAACGCGGAATTCCTATTTCCCCTGCCTGACTAAPCR of TetR5 sequenceTetR6CGGGATCCATGACCACTTCCCAGCCCGGAATTCTCAGCGACTTGCAGTTTCGPCR of TetR6 sequenceTetR7CGGGATCCATGGCACGCAAAACAAAGGAATTCCTAGGGTCTCGCCGGCPCR of TetR7 sequenceTetR8CGGGATCCATGATGACCATCATGAATAAAGGAATTCTTACTTGATGGCTTTGTAGTGPCR of TetR8 sequenceTetR9CGGGATCCATGTCTCCATTACGGGCGGAATTCTCAGCTTTTAAGTGCGTTAPCR of TetR9 sequenceTetR10CGGGATCCATGGCTGGAGAACGCAACCCTCGAGTCAGTTGATCAGCAGCCCPCR of TetR10 sequence

篩選培養(yǎng)基：瓊脂粉1.5 g，ddH2O 76 mL，調節(jié)pH至6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min，瓊脂冷卻至70 ℃加入10 mL10×M9 salts，混合均勻，待混合物冷卻至50 ℃時，加入M9 Media Additive 13.5 mL，氯霉素100 μL，鏈霉素100 μL，四環(huán)素50 μL，3-amino-1，2，4-triazole (3-AT) 1 mL。用于單雜交篩選，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.1.3 主要試劑

質粒提取試劑盒、純化PCR產物試劑盒均購自全式金生物技術有限公司，限制性內切酶、T4連接酶購自Thermo公司。

1.2 DNA基本操作與分析

大腸埃希菌質粒提取、PCR產物擴增、 DNA的限制性酶切與酶連反應、酶連產物和質粒的轉化、DNA凝膠電泳等常規(guī)分子生物學實驗操作參照《分子克隆實驗指南》[17]。

1.3 轉錄因子亞文庫的構建

使用關鍵詞“regulator”“sigma”“sensor”“two component”對MP688全基因注釋信息(GenBank編號：NC_014733.1)和轉錄組結果進行搜索，找到相關基因的核苷酸序列即為候選轉錄因子序列。我們分類查找到LuxR、LysR、TetR家族特異性轉錄因子，以MP688菌株的基因組為模板PCR擴增得到轉錄因子共計32個。將各轉錄因子與文庫載體pTRG進行酶切位點分析，查找合適的酶切位點BamHⅠ、EcoRⅠ或XhoⅠ，進行重組質粒的構建，得到的一系列質粒即構成了甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp. MP688的轉錄因子亞文庫。

1.4 細菌單雜交篩選模型建立與應用

1.4.1 共轉化菌株的構建

由于B2H validation strain感受態(tài)細胞的質粒中存在卡那霉素抗性基因，文庫載體含有四環(huán)素抗性基因，而報告質粒中存在氯霉素抗性基因，因此在含3種抗生素的培養(yǎng)基上生長的菌落可以視為已經轉入了重組質粒與報告質粒，即共轉化成功。將文庫載體和重組報告質粒各8 μL共轉化到50 μL B2H validation strain感受態(tài)細胞中，涂布到含卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～14 h，長出的菌落即為共轉化菌株。

1.4.2 點種及培養(yǎng)

接種所構建的共轉化菌株單菌落至LB液體培養(yǎng)基(卡納霉素、四環(huán)素、氯霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)。將篩選平板與對照保存平板(添加有3種抗性的LB平板)置于超凈工作臺中，適當打開平皿蓋以吹干培養(yǎng)基表面的多余水分，并且保證培養(yǎng)基表面不會過于干燥，取所接種的共轉化子菌液2 μL分別點種于篩選平板及對照保存平板，點種后將平板正向置于30 ℃培養(yǎng)箱中約30 min，待所點菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置避光培養(yǎng)。

1.4.3 篩選平板上菌落生長情況的觀察

將篩選平板與對照平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12 h，取出觀察并記錄菌落生長情況，主要包括菌落是否生長、菌落形態(tài)、相對生長趨勢等。平板繼續(xù)倒置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h左右按照相同標準觀察并記錄篩選平板，培養(yǎng)至第3天為止。啟動子與轉錄因子相互作用的強弱主要表現在菌落的生長情況，因此可根據菌株生長情況判斷各轉錄因子是否與甲醇脫氫酶啟動子發(fā)生相互作用及相互作用的強弱。

1.4.4 陰性對照自激活驗證及3-AT濃度確定

將pTRG空質粒和克隆有甲醇脫氫酶啟動子序列的pROMOTER質粒共轉化到報告菌株B2H validation strain中，在篩選培養(yǎng)基中觀察報告基因的表達狀況。若有菌落生長則在培養(yǎng)基中添加不同濃度的3-AT，直至培養(yǎng)基上無菌落生長。

1.4.5 甲基營養(yǎng)菌中DNA-蛋白質相互作用的陽性對照的篩選

以模式菌MethylobacteriumextorquensAM1的AM1_glyA、AM1_qsr基因為參考，與Methylovorussp. MP688全基因組進行同源分析，得到同源性較高的基因mpq_0872、mpq_1945，并查找RNA聚合酶的不同亞基得到MPQ_0345、MPQ_2317、MPQ_0345CTD的相關基因序列，以此作為陽性對照的候選因子。

1.4.6 MPQ_1945陽性對照蛋白的構建與表達

將PCR擴增的mpq_1945基因經NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，選擇表達載體pET-15b，用NdeⅠ和BamHⅠ線性化此載體，然后用T4連接酶連接雙酶切的mpq_1945基因片段及線性化pET-15b載體，構建mpq_1945的表達質粒。再轉化至E.coliBL21感受態(tài)細胞中。挑選正確的轉化子菌株接種至含1 μg·mL-1氨芐抗生素培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后以1%接種量轉接該菌液到100 mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數生長期(D600=0.4)后加入IPTG至終濃度依次為0.10、0.25、0.50 mmol·L-1，20 ℃誘導過夜培養(yǎng)，離心菌液收集表達菌體，所得菌體經超聲波破碎(Pulse on 3 s，off 6 s)后，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液用鎳柱親和層析法純化蛋白，10% SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和純化情況。

1.4.7 凝膠阻滯實驗(EMSA)

將mpq_0872基因啟動子的DNA片段和MPQ_1945蛋白以一定比例添加至1.5 mL離心管，加入10×反應緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.5，100 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1EDTA，0.5 mmol·L-1MgCl2)混勻，4 ℃靜置孵育2 h，體系見表3。制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，體系總體積10 mL，含5×TBE 1mL，30%聚丙烯酰胺2.2 mL，80%甘油80 μL，10%過硫酸銨90 μL，四甲基乙二胺10 μL，去離子水6.62 mL。加樣前先在預冷的0.5×TBE 緩沖液中120 V預電泳10 min，電泳完畢后沖洗加樣孔。將混合樣品進行點樣電泳，將電泳槽置于冰上或4 ℃環(huán)境中，恒壓100 V進行電泳。電泳結束后用溴化乙錠染色。

2 結果與分析

2.1 轉錄因子亞文庫的構建

LuxR、LysR、TetR家族轉錄因子在細菌中普遍存在，并與多種次級代謝產物合成密切相關，通過對甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp. MP688全基因組及轉錄組測序結果的分析，并對LuxR、LysR、TetR家族的32個轉錄因子基因分類整理，結果表明，有11個轉錄因子基因屬于LuxR家族，有11個轉錄因子基因屬于LysR家族，有9個轉錄因子基因屬于TetR家族。針對LuxR家族、LysR家族轉錄因子基因設計特異性引物，擴增目的因子并與pTRG質?？寺?，構建重組質粒，經酶切驗證，構建成功的LuxR轉錄因子亞文庫有6個，分別為LuxR1、LuxR2、LuxR5、LuxR6、LuxR7、LuxR8；LysR轉錄因子亞文庫有5個，分別為LysR1、LysR2、LysR4、LysR5、LysR6。

表3EMSA反應體系

Table3EMSA reaction system

反應體系Reaction system12345啟動子Promoter/μL07777蛋白Protein/μL6640610×緩沖液10×Buffer/μL22222ddH2O/μL1257115體積Volume/μL2020202020

1，反應體系中僅含有MPQ_1945蛋白； 2、3，反應體系中含有mpq_0872基因的啟動子和MPQ_1945蛋白；4，反應體系中僅含有mpq_0872基因的啟動子；5，反應體系中含有mpq_0872基因的啟動子和陰性對照蛋白。

1，Reaction system contain protein MPQ_1945 only; 2-3，Reaction system contain promotermpq_0872 and protein MPQ_1945; 4，Reaction system contain promotermpq_0872 only; 5，Reaction system contain promotermpq_0872 and negative control protein.

2.2 陰性對照自激活驗證及3-AT濃度確定

由于轉錄因子能夠與RNA聚合酶的α亞基融合表達，將文庫載體及報告載體共轉化到宿主菌株中后，若調控蛋白和啟動子存在相互作用，α亞基便會牽引RNA聚合酶使其牢固地結合在目的啟動子區(qū)，從而激活之后的報告基因his3和aadA的轉錄表達。為了驗證在沒有啟動子時該系統(tǒng)是否具有自激活現象，設計陰性對照共轉化菌株的單雜交篩選。結果表明，陰性對照菌株在篩選平板上生長，證明有自激活現象，在培養(yǎng)基中添加2～4 mmol·L-1的3-AT能夠抑制其自激活。陰性對照在濃度為2、3 mmol·L-1的3-AT下可以生長，當濃度增至4 mmol·L-1時對照菌的生長被抑制，因而確定3-AT的最適篩選濃度為4 mmol·L-1，在此濃度下，能夠確保非特異性自激活被充分抑制，且抑制劑濃度最低。

2.3 甲基營養(yǎng)菌中DNA-蛋白質相互作用的陽性對照的篩選

由于MethylobacteriumextorquensAM1和Methylovorussp. MP688均為甲基營養(yǎng)型菌株，具有同源性。為了尋找甲基營養(yǎng)菌中具有相互作用的陽性對照，我們以與AM1具有相互作用的轉錄因子QSR為參考，對Methylovorussp. MP688基因組進行基因分析比對，將與AM1具有同源性的基因作為陽性候選基因并構建共轉化菌株。細菌單雜交篩選中，以4 mmol·L-13-AT濃度為基準，設定3-AT的濃度梯度為4、6、8、10 mmol·L-1。對其進行細菌單雜交篩選，結果表明，隨著3-AT濃度的增加，含不同轉錄因子的菌株長勢發(fā)生變化，如圖2所示，在4 mmol·L-13-AT濃度下，AM1_QSR、MPQ_0345、MPQ_0345CTD、MPQ_1945正常生長；濃度為6 mmol·L-1時，AM1_QSR、MPQ_0345、MPQ_1945能夠生長；濃度為8 mmol·L-1時，AM1_QSR、MPQ_1945繼續(xù)生長；濃度為10 mmol·L-1時，AM1_QSR、MPQ_1945仍能正常生長，最終確定MPQ_1945作為甲基營養(yǎng)菌細菌單雜交篩選模型的陽性對照。在此濃度下，能確保非特異性自激活被充分抑制，而含有MPQ_0872和MPQ_1945相互作用的菌株生長良好。

圖1 轉錄因子亞文庫的構建流程Fig.1 The construction of transcription factor sublibrary

2.4 陽性對照蛋白表達

陽性對照蛋白MPQ_1945進行IPTG濃度梯度優(yōu)化，最終在IPTG濃度為0.25 mmol·L-1時得到可溶性蛋白，用鎳柱親和層析進行純化得到目的蛋白，如圖3所示。

1，MPQ_1945；2，AM1_QSR；3，MPQ_0345CTD；4，MPQ_0345；5，AM1-pTRG；6，MPQ_pTRG.圖2 陽性對照相互作用篩選Fig.2 The screening of positive control interaction

2.5 凝膠阻滯實驗(EMSA)鑒定相互作用

細菌單雜交系統(tǒng)篩選出的DNA-蛋白質間相互作用的蛋白是否可靠，我們結合凝膠阻滯實驗來證實。將篩選的陽性MPQ_1945蛋白和mpq_0872基因的啟動子進行EMSA，反應體系見表3，經EB染色后，由于體系1沒有DNA，所以EB染色沒有條帶，體系2、3同時具有DNA和蛋白質，兩者結合后電泳時比無蛋白質的DNA游離的慢，因此EB染色滯后。體系4只有DNA，作為陽性對照DNA經EB染色后呈游離帶，體系5同時含有DNA和蛋白質，然而該蛋白質是甲基菌的無關蛋白，以體系5作為陰性對照，經EB染色后呈游離帶。EB染色結果如圖4所示，最終確定細菌單雜交系統(tǒng)能在甲基營養(yǎng)菌中應用并具有可靠性。

A： 1，未誘導菌體蛋白；2，誘導菌體蛋白；3，誘導菌體上清；4，誘導菌體沉淀。B： 1，未誘導菌體蛋白；2，誘導菌體上清；3，掛柱后上清；4，Wash buffer洗脫；5～9，Elution Buffer洗脫液。A: 1，Uninduced bacterial protein; 2，Induced bacterial protein; 3，Induced bacterial supernatant; 4，Induced bacterial precipitation.B: 1，Uninduced bacterial protein; 2，Induced bacterial protein; 3，Flow through after binding; 4，Elution by wash buffer; 5-9: Elution buffer.圖3 蛋白表達與純化Fig.3 Protein expression and purification

1，反應體系中只有MPQ_1945蛋白；2、3，反應體系中含有mpq_0872基因的啟動子片段與不同濃度的MPQ_1945蛋白；4，反應體系中只含有mpq_0872基因的啟動子片段；5，反應體系中含有mpq_0872基因的啟動子片段與陰性對照蛋白。1，Reaction system contain protein MPQ_1945 only; 2,3，Reaction system contain promoter mpq_0872 and different concentrations of protein MPQ_1945; 4，Reaction system contain promoter mpq_0872 only; 5，Reaction system contain promoter mpq_0872 and negative control protein.圖4 DNA-蛋白質結合凝膠阻滯實驗Fig.4 DNA-protein EMSA assay

2.6 甲醇脫氫酶啟動子細菌單雜交篩選

2.6.1 甲醇脫氫酶啟動子序列分析

通過生物信息學預測(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)mpq_0771基因前有一個得分高的強啟動子，如圖5所示。該啟動子的-10區(qū)和-35區(qū)以及可能的轉錄因子結合位點也標識出。因此我們設計PCR引物擴增了540 bp包含這部分功能區(qū)的片段，將構建到pROMOTER的報告基因前，通過細菌單雜交篩選這些DNA位點的結合蛋白。

2.6.2 甲醇脫氫酶啟動子細菌單雜交篩選

通過觀察和記錄含有不同濃度抑制劑3-AT的篩選培養(yǎng)基中共轉化子的生長狀況，可知隨著3-AT濃度的增加各共轉化菌株長勢不同，部分長勢良好，部分長勢較弱，說明與甲醇啟動子有不同程度作用結果。篩選結果中無相互作用的有1個，弱相互作用的有2個，中等作用的有6個，結果見表5，當3-AT濃度增加至15 mmol·L-1時陽性對照菌生長狀態(tài)趨于下降，而LuxR7、LuxR8的共轉化菌株長勢依舊良好，結果見圖6，表明LuxR7、LuxR8轉錄因子與報告載體上的甲醇脫氫酶啟動子具有很強的相互作用，相關結合蛋白的信息見表6。

下劃線，核心啟動子；粗體，-10區(qū)，-35區(qū)；黑色邊框，轉錄因子結合位點。Underline，Core promoter; Bold，-10，-35; Black border，Transcription factor binding site.圖5 甲醇脫氫酶基因(mpq_0771)啟動子區(qū)域序列分析Fig.5 The sequence analysis of methanol dehydrogenase gene (mpq_0771) promoter region

表5細菌單雜交篩選

Table5The bacterial-one-hybrid screening

轉錄因子名稱Name of regulators3-AT的濃度 The concentration of 3-AT/(mmol·L-1)6 8 101215 結論ConclusionLuxR1++++++++--中ModerateLuxR2-----無NoneLuxR5+----弱WeakLuxR6++++++++++-中ModerateLuxR7+++++++++++++++強StrongLuxR8+++++++++++++++強StrongLysR1++++++++++++中ModerateLysR2++++++++++++中ModerateLysR4++++++++++-中ModerateLysR5+++--弱WeakLysR6++++++++++-中Moderate

A： 1，陽性對照； 2，陰性對照；3，LuxR7； B： 1，陽性對照；2，LuxR8；3，陰性對照。A： 1，Positive control; 2，Negative control; 3，LuxR7; B： 1，Positive control; 2，LuxR8; 3，Negative control.圖6 共轉化篩選結果Fig.6 Co-transformation screening results

表6結合蛋白信息

Table6The information of binding proteins

結合蛋白Binding proteins功能注釋Function annotation序列號Gene ID分子大小Molecularweight/ku保守結構域數ConserveddomainsMPQ_0747LuxR1Two component LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999558534.541MPQ_1056LuxR5LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999589422.551MPQ_1422LuxR6two component LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999626023.541MPQ_1431LuxR7LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999626938.282MPQ_1438LuxR-8two component LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999627622.552MPQ_1017LysR1LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999585533.001MPQ_1140LysR2LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999597833.331MPQ_2042LysR5LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999688033.441MPQ_2057LysR6LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999689533.551MPQ_1945LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999678333.881

3 結論與討論

本實驗室構建的細菌單雜交系統(tǒng)從自身系統(tǒng)的驗證及將已知的轉錄因子和啟動子的相互作用作為對照來尋找最佳篩選條件，最終確定3-AT最適篩選濃度為4 mmol·L-1。由于細菌單雜交存在假陽性和假陰性的缺陷，我們用EMSA來進一步驗證所篩選的結果，EMSA實驗結果與單雜交結果一致，證明了細菌單雜交系統(tǒng)在甲基營養(yǎng)菌高通量篩選中的可行性[10-13]。

轉錄因子也稱為反式作用因子，是一類細胞核內的蛋白質因子，通過與順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來調節(jié)轉錄的活性。由于細菌mRNA分離困難，構建細菌cDNA文庫一直是學術界難點，而通常細菌基因組文庫的建立又由于采用基因組隨機斷裂的方法，存在著一些缺點，如：插入片段的隨機性和定向性差等缺點，因此采用這種方式構建細菌cDNA文庫對其文庫的覆蓋度和效率要求較高。本實驗基于甲基營養(yǎng)菌的全基因組序列，對其進行分析找到和轉錄調控有關的基因序列，包括LuxR、LysR、TetR家族轉錄因子總計32個，最后通過逐一擴增轉錄因子基因，來構建轉錄因子亞文庫。從而使文庫的庫容量和效率大大增加，同時由于篩選范圍的縮小，使篩選目標更具定向性。比如，甲基營養(yǎng)菌是合成PQQ的主要菌株，pqqABCDE等PQQ合成模塊基因雖然在不同菌株中存在差異，但這些基因的轉錄受到嚴格的調控[14-15]，目前關于PQQ合成調控的研究較少。本文建立的方法可用于高通量篩選PQQ合成模塊基因的啟動子結合蛋白，最終闡述甲基營養(yǎng)菌PQQ合成調控機制。

在基因的表達調控中，參與調控的轉錄因子是各種蛋白質，而核酸和蛋白質又是構成生命體最為重要的兩類生物大分子，因此研究蛋白質-蛋白質、DNA-蛋白質等生物大分子之間的相互作用對于人們在分子水平上深入理解各種生物學過程至關重要[16]。本實驗對細菌單雜交系統(tǒng)進行優(yōu)化使其成功應用于甲基營養(yǎng)菌，并利用細菌單雜交技術的獨有的優(yōu)點，篩選轉錄因子亞文庫，成功從32個轉錄因子中篩選出與甲基營養(yǎng)菌甲醇脫氫酶啟動子相互作用的蛋白，共計11個。這些與甲醇脫氫酶啟動子有相互作用的蛋白又表現出強弱程度的不同。為進一步闡明甲醇脫氫酶在甲基菌生長和代謝產物合成中的調控機制奠定了基礎。同時構建成功的文庫也能夠在其他基因轉錄因子篩選中得到應用，為構建PQQ高產菌株及詮釋PQQ合成基因的轉錄調控機制提供了理論依據。