樊 霆，伍玲麗，李云云，劉亞樓，劉 如，葉文玲，陳海燕，潘丹丹

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

耐鹽菌可在高鹽度環(huán)境生存，除在工業(yè)生產(chǎn)的生物技術(shù)中具有重要的地位[1]，還在石油污染治理、工業(yè)廢水處理、環(huán)境修復(fù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。從鹽湖、石油污染海水和污水處理廠污泥中篩選的BacillusbadiusD1、Achromobactersp. HZ01、Brevundimonasdiminuta、Acinetobactersp.、HalomonasxianhensisSUR308在1%～10%的鹽度范圍內(nèi)能生長(zhǎng)，并能降解蒽、石油烴類(lèi)、柴油、苯酚、辛烷等石油相關(guān)產(chǎn)品和污染物[3-8]。高鹽度工業(yè)廢水對(duì)傳統(tǒng)生物處理產(chǎn)生明顯的抑制作用[9]。宋晶等[10]直接馴化嗜鹽菌，采用序批式生物膜法處理高鹽廢水，出水COD去除率能達(dá)到90%以上；段金明等[11]從海洋沉積物中篩選出1株高效脫氮嗜鹽好氧反硝化菌SF16在含鹽廢水/富營(yíng)養(yǎng)化水體處理工程中具有良好應(yīng)用前景；張培玉等[12]研究了1株中度嗜鹽異硝化菌gs2的脫氮特性和耐鹽性能，結(jié)果表明該菌株可獨(dú)立完成生物脫氮的全過(guò)程；李維國(guó)等[13]從鹽場(chǎng)曬鹽池鹽水中分離1株中度嗜鹽菌株YS-1，對(duì)高鹽制革廢水生化處理具有強(qiáng)化功能。因此，篩選耐鹽菌株并研究其耐鹽機(jī)制十分重要。目前相關(guān)研究耐鹽菌主要是通過(guò)鹽堿地、曬鹽場(chǎng)、污水廠污泥、石油污染海水和沉積物中篩選得到，而從危險(xiǎn)廢物填埋場(chǎng)滲濾液中分離的極端耐鹽菌的研究較少。為此，本研究從危廢填埋場(chǎng)新鮮高鹽滲濾液中分離篩選出1株極度耐鹽菌株，通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)特性、耐鹽性及耐鹽機(jī)理等進(jìn)行初步分析，旨在為該菌株在高鹽環(huán)境中污染修復(fù)的應(yīng)用的進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

水樣取自合肥市吳山危險(xiǎn)廢物填埋場(chǎng)新鮮滲濾液，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行篩選。

SC培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 L，pH值7.6。固體培養(yǎng)基加瓊脂15.0～20.0 g·L-1。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 L，pH值7.0～7.3。

M63培養(yǎng)基[14]：K2HSO413.6 g，(NH4)2SO42.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg，MgSO40.25 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 L，pH值7.0～7.3。

以上培養(yǎng)基都需在121 ℃的高溫高壓條件下滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

STARTER 2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UV759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS CX41生物顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Z36 HK臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)HERMLE Labortechnik GmbH公司；HZ-9210K搖床，金壇市杰瑞爾電器有限公司；BSA224S電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PWT-P75B恒溫培養(yǎng)箱，合肥華德利科學(xué)器材有限公司；GR1100A立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，廈門(mén)致微儀器有限公司；SW-OJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣科技有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株NY-1的篩選

取吳山危險(xiǎn)廢物填埋場(chǎng)新鮮滲濾液，稀釋10倍、100倍涂布在SC固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng) 1～2 d。挑取單菌落至平板劃線培養(yǎng)，反復(fù)挑取分離后，接入具有10%、15%、20%和30%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SC固體培養(yǎng)基，多次純化后得到耐鹽的菌株(NY-1)，接入斜面30 ℃培養(yǎng)1 d，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株NY-1的鑒定

將篩選得到的菌株YN-1接種于SC固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，用肉眼觀察菌落形態(tài)[15]，并按文獻(xiàn)[16]對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，利用電子顯微鏡觀察。

菌種鑒定采用16S rDNA基因序列分析，使用TaKaRa 16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No. RR176)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse為引物擴(kuò)增出菌株的基因序列，測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)用BLAST軟件于GenBank中進(jìn)行同源性比較[17]。在MEGA 7.0軟件選擇鄰接法(Neighbor-Joining)對(duì)菌株的序列進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[18]。

1.3.3 菌懸液制備及培養(yǎng)條件

挑取生長(zhǎng)良好單菌落接種于SC液體培養(yǎng)基中30 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r·min-1下振蕩培養(yǎng)24 h，后4 000 r·min-1離心10 min，利用無(wú)菌水將菌體細(xì)胞反復(fù)清洗2～3次，再將菌體細(xì)胞重懸于無(wú)菌水中，制成每毫升約1.0×108個(gè)菌體細(xì)胞的菌懸液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 菌株NY-1的生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)

分別在不同的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、10%、15%、20%、25%、30%)，不同pH值(5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基(SC液體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和M63培養(yǎng)基)中，接種2 mL菌懸液，于30 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)2 d。在不同生長(zhǎng)期取得的菌懸液，采用分光光度計(jì)，測(cè)定菌液的D600(扣除培養(yǎng)基的D600值)，測(cè)定3次取平均值。

1.3.5 不同鹽度對(duì)NY-1胞內(nèi)陽(yáng)離子的影響實(shí)驗(yàn)

接種2 mL菌懸液于NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、10%、15%、20%、25%、30%的SC液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，取50 mL于5 000 r·min-1離心15 min，倒掉清液，加入10 mL去離子水與菌泥混勻后于水浴鍋內(nèi)沸水浴10 min，于12 000 r·min-1離心20 min取上清液定容到10 mL為待測(cè)樣品[19]，用ICP測(cè)定K+、Na+、Mg2+、Ca2+的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株NY-1的形態(tài)學(xué)特征

挑取單菌落至平板劃線培養(yǎng)，反復(fù)挑取分離純化獲得1株耐鹽菌株，編號(hào)為NY-1，在SC固體培養(yǎng)基上，菌株生長(zhǎng)較快，呈乳白色，正反面均勻一致；菌落小，邊緣整齊，單菌落為圓形，直徑1～2 mm；表面濕潤(rùn)光滑，均勻，有光澤，容易被挑起(圖1)。顯微鏡下觀察細(xì)胞呈桿狀，無(wú)芽孢，革蘭氏染色陰性(圖2)。

圖1 菌株NY-1的菌落特征Fig.1 The colony characteristics of strain NY-1

圖2 菌株NY-1的革蘭氏染色圖(1 000×)Fig.2 The Gram-staining of strain NY-1(1 000×)

2.1.2 NY-1的16S rDNA鑒定

對(duì)NY-1菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析，結(jié)果表明該片段有1 448 bp。將獲得的序列在 GenBank中使用Blast軟件進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明該序列與Achromobactersp.的16S rDNA序列的同源性高達(dá)99%。用MEGA 7.0軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，結(jié)果表明該菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與Achromobactersp.相似度達(dá)99%。綜合菌株的形態(tài)觀察、16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果，可確定NY-1菌株屬于無(wú)色桿菌屬(Achromobactersp.)。

2.2 菌株NY-1的生長(zhǎng)特性

2.2.1 不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株NY-1生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，菌株NY-1在0～30%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。CK與不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下菌株NY-1的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)大致相同。CK條件下，NY-1在6～11 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，0～6 h為停滯期，在6～10 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株NY-1在4個(gè)生長(zhǎng)階段均出現(xiàn)抑制作用。隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，對(duì)NY-1生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，生長(zhǎng)量持續(xù)降低，生長(zhǎng)速度明顯減緩，25%和30%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，生長(zhǎng)量急劇下降。

2.2.2 pH對(duì)菌株NY-1生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，菌株NY-1在pH值5.5～8.0范圍內(nèi)均有生長(zhǎng)。當(dāng)pH值小于6.5其生長(zhǎng)量都明顯降低，這可能是由于每種微生物都有其生長(zhǎng)的最適pH值，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響微生物酶的分泌及活性，從而抑制微生物生長(zhǎng)。因此弱堿性條件下最有利于菌株NY-1的生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)pH為7.0。

圖3 菌株 NY-1的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain NY-1 based on 16S rDNA gene sequence

圖4 不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下NY-1的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain NY-1 in different salinity

圖5 pH對(duì)NY-1生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of pH value on the growth of strain NY-1

2.2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株NY-1生長(zhǎng)的影響

圖6 不同培養(yǎng)基對(duì)NY-1生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different culture medium on the growth of strain NY-1

由圖6可知，NY-1在0～30%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SC培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、M63培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的耐鹽能力，在3種培養(yǎng)基中NY-1生長(zhǎng)隨鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在相同的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，NY-1在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量最大。

2.3 不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)NY-1胞內(nèi)陽(yáng)離子的影響

由圖7可以看出，NY-1在不同的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下細(xì)胞內(nèi)的Ca2+和Mg2+的含量都比較低，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，Ca2+和Mg2+濃度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，20%～30%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，Ca2+和Mg2+濃度趨于穩(wěn)定；K+濃度呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，在15%～20%時(shí)達(dá)到最大；Na+濃度呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，且增幅較大。

3 討論

高鹽度污染土壤和廢水都抑制傳統(tǒng)生物處理中非耐鹽微生物的生長(zhǎng)代謝，使生物處理效果降低甚至消失[20-21]。因此從長(zhǎng)期受鹽度污染的環(huán)境中篩選耐鹽菌株，是修復(fù)石油污染鹽堿化土壤和處理高鹽廢水的首要前提[22-24]。本文從危險(xiǎn)廢物填埋場(chǎng)垃圾滲濾液中獲得NY-1菌株，16S rDNA基因序列相似性搜索和系統(tǒng)發(fā)育地位的分析結(jié)果表明，菌株NY-1與Achromobactersp.、Alcaligenessp. LD114、AchromobacterdenitrificansS1、AchromobacterxylosoxidansAU1011在分子進(jìn)化上存在著近緣關(guān)系(圖2)。菌株NY-1與Achromobactersp.關(guān)系較為密切，結(jié)合形態(tài)觀察，該菌株為Achromobactersp.。

圖7 不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)NY-1胞內(nèi)陽(yáng)離子的影響Fig.7 Effects of different salinity on intracellular cations concentration of strain NY-1

本文篩選的Achromobactersp. NY-1菌株可以耐受0～30%的NaCl，最適宜的生長(zhǎng)鹽度為10%～20%，根據(jù)對(duì)鹽的耐受程度可將嗜鹽菌分為6類(lèi)[25]：非嗜鹽菌(以NaCl濃度計(jì)，<1.17%)、弱嗜鹽菌(1.17%～2.93%)、中等嗜鹽菌(2.93%～14.63%)、臨界極端嗜鹽菌(14.63%～23.38%)、極端嗜鹽菌(23.28%～34.48%)、極端耐鹽菌(非嗜鹽耐鹽度達(dá)14.63%)。因此，該菌屬于典型的極端耐鹽菌。耐鹽模式菌株H.werneckii和W.ichthyophaga可生長(zhǎng)的最高NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29%和30.4%[2]。此外，從環(huán)氧樹(shù)脂廢水處理系統(tǒng)的活性污泥中篩選的Bacillussp.和Virgibacillussp.最佳生長(zhǎng)條件為：溫度30 ℃，pH為7.0，NaCl為30 g·L-1[26]。因此，菌株NY-1具有極強(qiáng)的耐鹽性。

具有耐鹽能力的無(wú)色桿菌成員較少，從原油污染海灣篩選的Achromobactersp.，在NaCl 30 g·L-1，溫度28 ℃，pH 7.5條件下生長(zhǎng)最佳[4]。本文篩選的NY-1在pH為7.0、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～20%的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳。為能在高鹽環(huán)境中生存，細(xì)菌需消耗大量能量調(diào)整自身的代謝途徑來(lái)抵御高鹽環(huán)境，因此，用于生長(zhǎng)繁殖的能量相對(duì)減少，導(dǎo)致自身生長(zhǎng)緩慢[2]；NY-1在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，可能是因LB培養(yǎng)基中含有復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)組成，某些組分可能會(huì)被NY-1吸收利用或者對(duì)其產(chǎn)生某種生理作用，從而提高其耐鹽能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

高鹽脅迫下，大多數(shù)微生物在細(xì)胞內(nèi)會(huì)合成并積累相容性物質(zhì)，維持胞內(nèi)低水平的Na+濃度以免受毒害[27]，也可能具有濃縮K+和排斥Na+的能力，平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，在高鹽環(huán)境中保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并能很好地生存[28]。為了查明NY-1的耐鹽機(jī)制，本研究測(cè)定并分析了NY-1胞內(nèi)Ca2+、Mg2+、K+和Na+的濃度隨鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0升至20%時(shí)，NY-1細(xì)胞通過(guò)吸收K+和Na+來(lái)維持胞內(nèi)的滲透平衡，同時(shí)，NY-1需要通過(guò)釋放Ca2+和Mg2+來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的電中性的環(huán)境。當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于20%時(shí)，NY-1吸收運(yùn)輸K+的能力增強(qiáng)[29]，通過(guò)持續(xù)向外界釋放Na+來(lái)抵抗干擾，保證NY-1在高Na+條件下維持正常生長(zhǎng)，這與前人研究結(jié)果基本符合[19]。菌株NY-1極端耐鹽可能還存在其他的調(diào)節(jié)機(jī)制，如將Na+儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)特殊部位，抑制高鹽度對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用，以及胞內(nèi)在高鹽環(huán)境會(huì)合成并積累相容性物質(zhì)等，還需進(jìn)一步研究。另外，該菌株在高鹽廢水處理、石油污染水體和土壤修復(fù)的應(yīng)用研究還需進(jìn)行，本研究的結(jié)果可為進(jìn)一步探索該菌株的耐鹽機(jī)理以及抗鹽基因工程菌的研究提供理論及應(yīng)用基礎(chǔ)。