王志剛，劉澤平，胡云龍，劉 虹，朱曉慧

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，廣東 廣州 510640)

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)能夠有效提高土壤中的有效養(yǎng)分，并促進(jìn)植物的生長發(fā)育，由于其環(huán)境友好的特性，亦被譽(yù)為化肥最有效的替代品[1]。一株高效PGPR在植物根際土壤中的定殖能力是其實現(xiàn)促生能力的關(guān)鍵[2]，因此，檢測PGPR的定殖情況是根際促生菌研究領(lǐng)域的重點工作之一[3]。用于研究PGPR在植物體內(nèi)外定殖的常見標(biāo)記方法有抗生素標(biāo)記法、GFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)記法、DNA和RNA探針法等[4-5]。常慧萍等[6]將luxAB發(fā)光酶基因轉(zhuǎn)入到AzotobacterN2106中，闡明了其在小麥根際的定殖動態(tài)；張楠等[7]采用GFP標(biāo)記法對BacillusamyloliquefaciensSQR9進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其定殖主要發(fā)生在主根、側(cè)根及根毛區(qū)，而根尖區(qū)細(xì)菌數(shù)量較少。對PGPR菌株進(jìn)行分子標(biāo)記和定殖研究對于闡釋其促生機(jī)制和指導(dǎo)生產(chǎn)實踐具有重要意義。

植物桿菌屬(Plantibacter)菌株WZW03是從西瓜根際分離獲得的具有解鉀能力的高效西瓜根際促生菌，在連作土壤中能夠促進(jìn)西瓜植株生長，改善根系結(jié)構(gòu)，緩解西瓜連作障礙[8]，但是其根際定殖能力和促生機(jī)制尚不明確。本實驗擬采用生物法利用熒光質(zhì)料POT2-RFP標(biāo)記Plantibactersp. WZW03，研究轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性和其在西瓜根際的定殖促生能力，為植物根際促生菌個體生態(tài)學(xué)研究提供實驗參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為齊齊哈爾大學(xué)微生物實驗室從西瓜根際分離獲得的Plantibactersp. WZW03。熒光質(zhì)粒POT2-RFP由清華大學(xué)戴俊彪教授實驗室惠贈，具有氨芐西林(Amp)抗性，激發(fā)光波長為558 nm。

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化與培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基[9]，液體培養(yǎng)基不加瓊脂?？剐訪B培養(yǎng)基：每100 mL液體培養(yǎng)基中加入0.1 mL的50 mg·mL-1Amp溶液。西瓜幼苗根系對標(biāo)記菌株的吸附實驗采用MS半固體培養(yǎng)基[10]。

1.3 POT2-RFP標(biāo)記

添加ddH2O配置20 μg·mL-1的POT2-RFP質(zhì)粒溶液，于-20 ℃保存待用。

將Plantibactersp. WZW03活化后，接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至D600=0.6，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰浴10 min，5 000 r·min-1離心(4 ℃)10 min，棄上清，回收菌體，加入10 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1CaCl2，重懸菌體，冰浴60 min，5 000 r·min-1離心(4 ℃)，棄上清，加2 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1CaCl2，重懸菌體，用1 mL離心管分裝，每份100 μL，-80 ℃保藏待用。

取20 μg·mL-1的質(zhì)粒0.1 μL，加入100 μL剛解凍的菌液，輕彈混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，冰水混合物中靜置2 min。向離心管中加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基900 μL，30 ℃、270 r·min-1復(fù)蘇2 h，取100 μL涂布于帶有抗性(50 μg·mL-1Amp)的LB平板，同時取100 μL解凍的原菌液梯度稀釋涂布于LB平板上作為對照，培養(yǎng)48 h計數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率。

1.4 基因標(biāo)記菌株檢測

挑取生長在含Amp的 LB平板上的轉(zhuǎn)化子單菌落涂布到載玻片上，經(jīng)過固定處理后使用共聚焦顯微鏡拍照，通過檢測菌株是否具有紅色熒光以判斷POT2-RFP基因是否表達(dá)。將轉(zhuǎn)化后生長在含Amp的LB平板上的轉(zhuǎn)化子單菌落接種于含Amp的LB抗性液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)至D600=0.6，5 000 r·min-1離心去上清，菌體沉淀使用無菌水進(jìn)行懸浮，并通過熒光分光光度計(日立F-7000)對懸浮液進(jìn)行分析(激發(fā)光波長為558 nm)。

1.5 標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定性

將標(biāo)記菌株WZW03-P接種于含50 μg·mL-1Amp的LB液體抗性培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至D600=0.6，按1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將WZW03-P接種于無抗性LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，每24 h轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基一次，連續(xù)10次后，將菌液分別稀釋涂布到LB平板和抗性LB平板上，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行影印對比接種實驗[11]，接種穩(wěn)定菌株重復(fù)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢驗，直至穩(wěn)定性達(dá)到90%以上。

1.6 西瓜幼苗根系對標(biāo)記菌株的吸附

取籽粒大小一致的西瓜種子，用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HgCl2消毒10 min，用無菌水清洗5次，30 ℃條件下催芽，待西瓜胚根長至0.5 cm時，挑選長勢一致的萌發(fā)西瓜種子播種于含無菌MS半固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)14 d(28 ℃/光照12 h，18 ℃/黑暗12 h，相對濕度60%)，得到西瓜幼苗。將培養(yǎng)好的西瓜幼苗在無菌操作條件下從MS培養(yǎng)基中取出，使用無菌水對西瓜幼苗進(jìn)行清洗，洗掉根部帶有的瓊脂。WZW03-P在LB抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，3 000 r·min-1離心收集菌體，用無菌生理鹽水重懸至5.20×109cfu·mL-1，然后按照10倍梯度稀釋，制備不同濃度的菌懸液，貯存于10 mL試管中備用。將洗凈的西瓜幼苗浸入含有5.20×108cfu·mL-1菌懸液的試管中，室溫下分別浸入0.5、1、2、5、10、30、50、80、120 min。另取洗凈的西瓜幼苗浸入不同稀釋濃度的WZW03-P懸液中，室溫靜置30 min。實驗需要對各樣品進(jìn)行處理，即去掉西瓜幼苗的莖葉，使用無菌濾紙將西瓜幼苗根部菌液吸干，研磨稀釋后在抗性LB培養(yǎng)基涂布計數(shù)，重復(fù)3次，計算菌株的吸附數(shù)量(cfu·g-1)。

1.7 菌株的土壤存活率檢測

取過2 mm篩的滅菌土和未滅菌自然土各400 g，加入30 mL 5.20×108cfu·mL-1的WZW03-P菌液(制備方法與1.6節(jié)相同)充分?jǐn)嚢?，分別標(biāo)記為S-WZW03-P和N-WZW03-P，同時設(shè)置滅菌土對照(S-CK)和自然土對照(N-CK)，并保持含水量在30%左右，置于18 ℃和相對濕度60%的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每5 d隨機(jī)取出3 g土壤，采用LB抗性培養(yǎng)基平板計數(shù)法監(jiān)測WZW03-P的存活量，每個處理重復(fù)3次。

1.8 菌株的促生及定殖檢測

使用Amp抗性LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)WZW03-P至D600=0.5。按照1.6節(jié)的方法處理西瓜種子，待西瓜胚根長至0.5 cm時，將長勢一致的萌發(fā)西瓜種子分別播種于添加了30 mL菌液的滅菌土(S-WZW03-P)和未滅菌土(N-WZW03-P)中，設(shè)置滅菌對照(S-CK)和未滅菌對照(N-CK)，共計4個處理。置于智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)30 d(30 ℃/光照12 h，18 ℃/黑暗12 h，相對濕度60%)，測量相關(guān)指標(biāo)。采用根系分析系統(tǒng)(GXY-A)掃描根系，分析總根長、根表面積、根系平均直徑和根體積。

45 d后收集西瓜幼苗的根際(0～0.2 cm)、近根(1～2 cm)、遠(yuǎn)根(5～6 cm)土壤，每個處理收集1 g土壤，120 r·min-1振蕩30 min后梯度稀釋，將稀釋液涂布于帶有Amp(50 μg·mL-1)抗性的LB平板中，30 ℃培養(yǎng)2 d，平板計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化子驗證

POT2-RFP質(zhì)粒具有Amp抗性，標(biāo)記成功的菌株能夠在含Amp抗性的LB平板中生長。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子濃度達(dá)到(12.30±3.51) cfu·mL-1，活菌濃度為(6.07±0.45)×106cfu·mL-1，轉(zhuǎn)化率為2.03×10-6。在共聚焦熒光顯微鏡下，標(biāo)記菌株WZW03-P發(fā)出紅色熒光(圖1-A)，表明質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)化并表達(dá)。質(zhì)粒POT2-RFP含有紅色熒光基因，其最大激發(fā)光為558 nm，由圖1-B可知，在558 nm的激發(fā)光下，在650～700 nm產(chǎn)生熒光，其中最大熒光波長為672.6 nm，屬于紅光區(qū)段，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

2.2 轉(zhuǎn)化子WZW03-P穩(wěn)定性和生長特性

以10代為一個循環(huán)，檢測到第3個循環(huán)時，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性達(dá)到99%(圖2-A)，可以實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，完全可以進(jìn)入到下一步實驗研究。對WZW03-P和WZW03進(jìn)行生長曲線測定，由圖2-B可知，WZW03-P和WZW03在對數(shù)期和穩(wěn)定期均表現(xiàn)出相似的生長態(tài)勢，雖然WZW03-P的生物量相較于WZW03偏低，但是在75 h時統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(P>0.05)。

2.3 西瓜幼根對WZW03-P的吸附特性

西瓜幼根浸入菌液后，隨著浸入時間延長，吸附量不斷增大，50 min時吸附量達(dá)到最大，(50.87±0.06)×105cfu·g-1(表1)。28 ℃條件下將西瓜幼苗浸入不同濃度的WZW03-P菌懸液中，隨著菌液濃度的增大，幼根吸附量也不斷增大，菌液濃度達(dá)到5.2×108cfu·mL-1時，西瓜根系吸附量基本達(dá)到飽和，不再隨著菌液濃度的增加而增加(表2)。

圖1 轉(zhuǎn)化子Plantibacter sp. WZW03-P的熒光檢測Fig.1 Fluorescence detection of Plantibacter sp. WZW03-P

圖2 轉(zhuǎn)化子WZW03-P遺傳穩(wěn)定性與生長特性Fig.2 Genetic stability and growth characteristics of WZW03-P

表1WZW03在西瓜根系的吸附動態(tài)

Table1Adsorption dynamics of WZW03 in watermelon root

吸附時間Adsorption time/min吸附量Adsorption quantity/(105 cfu·g-1)0.54.34±0.04110.46±0.10218.87±0.12522.98±0.091024.76±1.203032.87±0.195050.87±0.068042.56±0.0112038.98±0.07

2.4 WZW03-P在土壤中的存活量檢測

通過檢測菌株在滅菌土和自然土中的生物量可知，加入菌株后，菌株生物量即開始下降，0～5 d下降速率最為顯著，5～20 d之間下降速率趨緩，20 d后菌株的數(shù)量基本穩(wěn)定在106cfu·g-1左右(圖3)。在25 d的監(jiān)測期內(nèi)，自然土壤中的WZW03-P數(shù)量始終高于滅菌土壤，說明菌株在自然土壤中定殖能力較強(qiáng)，且可能與土壤中的其他微生物存在協(xié)同效應(yīng)，說明菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.5 WZW03-P對西瓜幼苗生長的影響

由表3可知，與S-CK相比，S-WZW03-P的西瓜幼苗地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著提高(P<0.05)，增幅分別為58.0%和40.0%。與N-CK相比，在自然土壤中經(jīng)WZW03-P處理后，西瓜幼苗地上部和地下部干質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)，增幅分別為80.0%和50.0%。

表2菌液濃度對WZW03在西瓜根系吸附的影響

Table2Effect of bacteria concentration on adsorption of WZW03 in watermelon root

菌液濃度Bacteria concentration/(cfu·mL-1)吸附量Adsorption quantity/(cfu·g-1)5.20×10105.20×10205.20×10343.21±2.445.20×104(5.13±1.56)×1035.20×105(1.12±0.74)×1045.20×106(1.61±0.56)×1055.20×107(1.66±0.21)×1065.20×108(1.27±0.34)×1075.20×109(1.36±0.46)×107

圖3 WZW03-P在土壤中的存活動態(tài)Fig.3 Dynamics of WZW03-P in soil

由圖4可知，在滅菌土壤中，相較于S-CK，S-WZW03-P的西瓜幼苗在總根長、根表面積和根體積上都顯著增加，根系平均直徑增加量不顯著。在自然土壤中，較于N-CK，N-WZW03-P的西瓜幼苗在總根長、根表面積和根體積也增加顯著，根系平均直徑增加量不顯著。滅菌土 (S-CK和S-WZW03-P) 中的西瓜幼苗根系相較于自然土 (N-CK和N-WZW03-P)，各項指標(biāo)差異不顯著，說明菌株WZW03-P在滅菌和自然土壤中均能發(fā)揮較好的促生效應(yīng)。

表3菌株WZW03-P對西瓜幼苗生長的影響

Table3Effects of WZW03-P on seedling growth of watermelon

處理Treatments莖粗Stemdiameter/mm株高Plantheight/mm地上部分 Ground part鮮質(zhì)量Fresh weight/g干質(zhì)量Dry weight/g地下部分 Underground part鮮質(zhì)量Fresh weight/g干質(zhì)量Dry weight/gS-CK2.661±0.182 a69.003±4.572 a1.221±0.230 ab0.080±0.021 a0.081±0.017 b0.005±0.001 bS-WZW03-P2.772±0.224 a65.624±5.712 a1.332±0.287 a0.077±0.021 ab0.128±0.037 a0.007±0.001 aN-CK2.543±0.195 a64.534±9.653 a0.811±0.014 b0.047±0.003 b0.079±0.027 b0.004±0.002 bN-WZW03-P2.634±0.192 a67.661±6.873 a1.002±0.299 ab0.085±0.001 a0.097±0.030 ab0.006±0.001 a

生物量以單株苗計。同列數(shù)據(jù)后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Biomass was measured based on single plant. Data followed by no same letters within the same column indicated significant difference atP<0.05.

圖4 菌株WZW03-P對西瓜幼苗根系的影響Fig.4 Effect of WZW03-P on watermelon seedling root

2.6 WZW03-P在西瓜根際的定殖能力

由圖5可知，在S-WZW03-P和N-WZW03-P中，WZW03-P在土壤中的定殖數(shù)量從高到低均表現(xiàn)為根際(0～0.2 cm)>近根(1～2 cm)>遠(yuǎn)根(5～6 cm)。在S-WZW03-P和N-WZW03-P根際土中，菌株的定殖數(shù)量分別達(dá)到2.15×106cfu·g-1和2.70×105cfu·g-1。在根際和近根區(qū)域滅菌土壤中的菌株WZW03-P含量遠(yuǎn)高于未滅菌土壤，但是遠(yuǎn)離根際的土體中，二者WZW03-P菌株含量均較低，且沒有顯著差異。

圖5 菌株WZW03-P于不同根系范圍的定殖情況Fig.5 Colonization of WZW03-P in different root systems

3 討論

PGPR能夠定殖于植物根部，通過分泌各類次級代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長，其定殖能力是影響植物生長的關(guān)鍵因素，檢測PGPR的定殖情況是研究PGPR的一個重要途徑。分子標(biāo)記是研究PGPR作用機(jī)理及定殖規(guī)律的重要手段之一[12]。Leff等[13]使用熒光質(zhì)粒對Escherichiacoli進(jìn)行熒光標(biāo)記，熒光基因在短時間內(nèi)消失。本實驗通過生物法將熒光質(zhì)粒POT2-RFP轉(zhuǎn)入WZW03號菌株，轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)過多次傳代后仍具有較好的熒光表達(dá)能力，遺傳性較為穩(wěn)定。車建美等[14]熒光標(biāo)記的清枯雷爾氏菌與野生株相比出現(xiàn)生長滯后的現(xiàn)象，本實驗轉(zhuǎn)化后的菌株WZW03-P的生長特性與未轉(zhuǎn)化的WZW03相比生物量略有下降，但是差異不顯著，完全可以應(yīng)用于后續(xù)研究。促生菌吸附于作物根表是形成定殖的必要條件[15]，也是促生菌起到促生作用的關(guān)鍵[16]。WZW03-P接種土壤中20 d后定殖數(shù)量趨于穩(wěn)定，與Xanthomonassp. P5310的定殖特點類似[17]。WZW03-P在滅菌和未滅菌土壤中，均對西瓜植株生長具有促生效應(yīng)，說明菌株在土壤中具有明顯的競爭優(yōu)勢，促生效果明顯，同時能夠顯著優(yōu)化根系結(jié)構(gòu)，促進(jìn)根系總根長、根表面積和根體積增加。距離西瓜根際越近，菌株WZW03-P在土壤中的含量就越高，說明菌株具有良好的定殖能力與競爭優(yōu)勢，且與作物根系之間可能存在互利共生關(guān)系[18]。