孫樂樂 蘇瑩瑩 高延靜 李威 呂慧 李賓 李迪

摘 要 生物大分子參與生命活動(dòng)的各個(gè)過程，在單分子水平上實(shí)時(shí)觀測和分析生物大分子自身的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)以及生物大分子相互作用的動(dòng)態(tài)過程，對(duì)于深入理解生物大分子的作用機(jī)制具有重要意義。自提出以來，單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)逐漸展現(xiàn)出其在研究生物大分子構(gòu)象變化和相互作用過程等方面的巨大潛力，一系列新的作用機(jī)理陸續(xù)被提出。本文對(duì)單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在蛋白質(zhì)與核酸分子構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)-核酸相互作用等方面取得的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移； 生物大分子； 構(gòu)象動(dòng)態(tài)； 相互作用； 評(píng)述

1 引 言

細(xì)胞生命活動(dòng)各個(gè)過程都離不開蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子。研究生物大分子的作用機(jī)制對(duì)于理解基本生物學(xué)過程至關(guān)重要，然而普通的生物學(xué)研究手段無法實(shí)時(shí)觀測生物大分子發(fā)揮作用時(shí)的狀態(tài)變化，只能間接地觀測宏觀現(xiàn)象，然后對(duì)過程機(jī)制進(jìn)行推斷。依據(jù)宏觀現(xiàn)象推出的作用機(jī)理只能在一定程度上幫助人們認(rèn)識(shí)生物過程，生物分子究竟如何發(fā)揮作用，必須有微觀的證據(jù)才更有說服力，例如ATP合成酶的作用機(jī)制、G蛋白偶聯(lián)受體如何傳遞信號(hào)等，都是在取得單分子水平上的證據(jù)后才得到更加深入的認(rèn)識(shí)[1～3]。對(duì)于宏觀系綜研究， 單分子研究的最大優(yōu)勢是可以直接觀測到單個(gè)生物分子發(fā)揮作用時(shí)的構(gòu)象動(dòng)態(tài)或生物分子間相互作用時(shí)分子間距離的變化[4～8]，獲取的機(jī)制更加接近真實(shí)情況。此外，單分子水平的研究能夠揭示生物分子之間的個(gè)體差異[9]，有助于全面深入地認(rèn)識(shí)生物分子的功能性質(zhì)。

目前，在單分子水平研究生物分子構(gòu)象變化或生物分子相互作用動(dòng)態(tài)過程的技術(shù)有光鑷[10]、 磁鑷[11，12]、原子力顯微鏡[13～16]及單分子熒光技術(shù)[17～21]。光鑷和磁鑷技術(shù)要求高，操作難度大，無法進(jìn)行高通量研究；原子力顯微鏡的成像時(shí)間分辨率低，因此在單分子研究方面應(yīng)用不多。單分子熒光技術(shù)起源于20世紀(jì)90年代[17]，目前已經(jīng)逐漸成熟地被用于生物學(xué)領(lǐng)域，并出現(xiàn)多個(gè)分支，其中單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（SM-FRET）被廣泛用于生物分子相互作用的研究[22]。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)是指能夠觀測單個(gè)生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉(zhuǎn)移的技術(shù)[23]，具有以下優(yōu)勢：（1）熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理使其能夠觀測到生物大分子發(fā)揮功能時(shí)不同結(jié)構(gòu)域或亞基之間空間位置的變化，或者分子之間相對(duì)距離的變化[23]，這些變化對(duì)于直接理解生物分子的作用機(jī)制十分重要； （2）目前全內(nèi)反射熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于SM-FRET研究，其利用激光全反射產(chǎn)生的隱逝波進(jìn)行照明，具有極高的信噪比，能夠觀測到界面上單個(gè)熒光分子；同時(shí)利用高速的制冷型電荷耦合器件（CCD）進(jìn)行成像，時(shí)間分辨率可以達(dá)到亞毫秒水平。該高時(shí)間分辨率對(duì)于實(shí)時(shí)觀測快速的相互作用或構(gòu)象變化過程至關(guān)重要[24]； （3）光學(xué)成像允許同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行觀測，高通量觀測便于比對(duì)被研究對(duì)象個(gè)體之間的差異； （4）成熟的基因工程技術(shù)和化學(xué)修飾方法使得研究者能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)或核酸分子進(jìn)行定點(diǎn)熒光標(biāo)記[25～28]，同時(shí)，豐富的界面封閉和目標(biāo)物固定方法可以保證觀測的特異性[23]。自1996年，基于SM-FRET技術(shù)的研究取得了一系列成果[29]。本文將圍繞單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在蛋白分子自身構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化[30～38]、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)相互作用[6，7，39]、核酸分子自身構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化[40～47]以及蛋白質(zhì)-核酸動(dòng)態(tài)相互作用[48～62]等方面取得的一些代表性研究成果進(jìn)行綜述。

2 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象是供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的激發(fā)光譜相重疊，且兩個(gè)分子間距離小于10 nm時(shí)，供體的激發(fā)能誘發(fā)受體發(fā)出熒光，同時(shí)供體自身的熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象，在生物學(xué)研究中常被用于鑒定兩種蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生相互作用。SM-FRET技術(shù)是觀測單個(gè)生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉(zhuǎn)移。目前，SM-FRET實(shí)驗(yàn)中最常用的成像儀器是全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM），包括棱鏡型和物鏡型兩類（圖1A）[63]。商業(yè)化的TIRFM多為物鏡型，這是因?yàn)槲镧R型TIRFM激發(fā)光和熒光都經(jīng)過物鏡，樣品臺(tái)有更大的操作空間，能夠更好的與其它設(shè)備聯(lián)用，如顯微操作設(shè)備。除了設(shè)備，SM-FRET實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的是研究對(duì)象的定點(diǎn)熒光標(biāo)記以及對(duì)象在界面上的特異性固定。核酸定點(diǎn)標(biāo)記比較容易，蛋白定點(diǎn)標(biāo)記則要依賴基因工程手段，還要保證標(biāo)記的位點(diǎn)不影響蛋白結(jié)構(gòu)。將研究對(duì)象特異性地固定在石英片或蓋玻片表面，對(duì)于觀測實(shí)驗(yàn)十分重要，目前常用的方式是用聚乙二醇（PEG）封閉玻璃表面，然后通過抗體或生物素-親和素進(jìn)行固定（圖1B）[63]。SM-FRET實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)是熒光供體和受體分子熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化的軌跡，然后通過表觀FRET效率方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的FRET效率隨時(shí)間變化的軌跡（圖1C）[63]，進(jìn)而對(duì)FRET效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得變化規(guī)律。

3 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用于生物大分子構(gòu)象和相互作用動(dòng)態(tài)研究

3.1 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究蛋白分子構(gòu)象動(dòng)態(tài)

蛋白質(zhì)分子的折疊和構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化直接關(guān)系到其自身功能，研究蛋白質(zhì)折疊過程和構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化，有助于理解蛋白分子形成功能結(jié)構(gòu)及發(fā)揮功能的機(jī)理。1999年，Ha等[30]首次將SM-FRET應(yīng)用于單個(gè)葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease，SNase）分子的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)研究。他們將熒光供體（Tetramethylrhodamine，TMR）和熒光受體（Cy5）修飾到SNase的兩個(gè)特定位點(diǎn)上，通過觀測分析單個(gè)SNase上TMR和Cy5的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，發(fā)現(xiàn)SNase分子之間存在不同的構(gòu)象波動(dòng)模式，這歸因于蛋白骨架結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈在毫秒級(jí)時(shí)間范圍內(nèi)的波動(dòng)。同時(shí)，他們通過觀測分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移獲得了SNase與單個(gè)底物DNA分子之間的動(dòng)態(tài)相互作用信息。該研究為后續(xù)研究單個(gè)蛋白分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)以及蛋白折疊提供了新思路。

利用示綜研究手段研究非均相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中的波動(dòng)，以及相關(guān)的酶結(jié)構(gòu)的變化行為，復(fù)雜反應(yīng)中非同步的性質(zhì)等十分困難[9]。Chen等[31]研究了T4溶菌酶在催化大腸桿菌的細(xì)胞壁水解反應(yīng)時(shí)的結(jié)構(gòu)變化信息。他們?cè)诿傅膬蓚€(gè)互不干擾位點(diǎn)特異性地修飾熒光供體-受體分子對(duì)，通過分析供體和受體分子熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化信息可以得到酶的鉸鏈彎曲行為，發(fā)現(xiàn)每個(gè)酶分子的催化反應(yīng)的速率常數(shù)之間存在較大的差異性。

包含未折疊或弱折疊域的天然無序蛋白（Intrinsically disordered proteins，IDPs）在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，IκBα是IDPs的典型代表[64]。研究表明， IκBα可通過其不穩(wěn)定的錨蛋白重復(fù)區(qū)（Ankyrin repeat 5-6，AR5-6）結(jié)合并調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NFκB的功能[65]，但是難以獲得關(guān)于AR5-6結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)信息。Lamboy等[32]通過SM-FRET研究發(fā)現(xiàn)，自然態(tài)的IκBα的結(jié)構(gòu)并不是固定不變的（圖2A），長時(shí)間的觀測結(jié)果表明IκBα可以在緊密的折疊態(tài)和松弛的不穩(wěn)定態(tài)之間發(fā)生轉(zhuǎn)換，但后者是主要狀態(tài)（圖2B）。另外，在結(jié)合NFκB后，IκBα的結(jié)構(gòu)波動(dòng)受到抑制（圖2C）。IDPs的不穩(wěn)定區(qū)結(jié)構(gòu)波動(dòng)較大，適合用SM-FRET進(jìn)行觀測，因此SM-FRET還被用于研究其它與疾病相關(guān)的IDPs，如α-Synuclein[66] 和 p53[67]，這些研究取得了傳統(tǒng)手段無法獲取的單分子動(dòng)態(tài)信息，加深了對(duì)IDPs的理解。

3.2 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)相互作用

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用普遍存在于生命活動(dòng)的各個(gè)過程，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成等[70，71]。細(xì)胞膜表面受體響應(yīng)配體信號(hào)發(fā)生聚集的過程對(duì)于有些受體活化是必須的，了解基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的受體-配體復(fù)合物形成過程對(duì)于研究信號(hào)如何傳遞十分重要。Sako等[7]將SM-FRET和單分子追蹤（Single-molecular tracking，SMT）技術(shù)結(jié)合，實(shí)時(shí)檢測熒光修飾的表皮生長因子（EGF）與其受體（EGF-EGFR）的結(jié)合過程和EGF-EGFR復(fù)合物的聚合過程（圖3A）。他們通過對(duì)獲取的單分子軌跡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)EGF分子首先和一個(gè)EGFR二聚體結(jié)合成復(fù)合物，然后直接結(jié)合第二個(gè)EGF分子。他們推測EGFR二聚體在結(jié)合第二個(gè)EGF之前已經(jīng)形成了二聚體，進(jìn)而通過SM-FRET實(shí)驗(yàn)直接證明了EGF-EGFR二聚體的形成（圖3B）。

原核和真核生物經(jīng)常利用能在細(xì)胞的質(zhì)膜形成孔道的毒蛋白（Pore-forming toxins，PFTs）來殺死其它細(xì)胞，在細(xì)菌毒性方面發(fā)揮重要作用[72]。PFTs的形成一般是多個(gè)水溶性的前體蛋白單體結(jié)合到細(xì)胞膜上，然后前體蛋白發(fā)生構(gòu)象變化進(jìn)而相互結(jié)合組裝成孔道[73]。了解孔道形成的過程機(jī)制有助于理論研究和相關(guān)藥物研發(fā)，但是由于孔道形成過程中涉及多種動(dòng)力學(xué)中間體，傳統(tǒng)方法難以對(duì)整個(gè)過程進(jìn)行研究。Nguyen等[6]首次利用SM-FRET研究了紅細(xì)胞膜表面γ溶血素的協(xié)同自組裝過程。金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素快速組分（LukF）和γ溶血素第二組分（HS）是組成細(xì)胞膜表面γ溶血素的兩個(gè)部分，他們?cè)谇绑w蛋白LukF和HS的特異位點(diǎn)上分別修飾TMR（熒光供體）和IC5（熒光受體），通過觀測和分析紅細(xì)胞膜上兩種前體蛋白的FRET信號(hào)及受體單獨(dú)的熒光信號(hào)，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)低聚物的亞基的數(shù)量。他們推測在單體和細(xì)胞膜結(jié)合、低聚物成孔以及最后形成孔團(tuán)簇的的自組裝途徑中，存在多種低聚物中間體。通過檢測序列中間態(tài)的結(jié)合平衡常數(shù)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)過程大概包含有11個(gè)序列平衡常數(shù)，存在3種協(xié)同聚合狀態(tài)，分別是二聚和二聚體的相互聚合、單孔的自組裝以及孔的聚合。這種將單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法應(yīng)用在單分子層面上對(duì)蛋白聚合中間體的觀察和分析，為研究細(xì)胞膜表面蛋白的動(dòng)態(tài)相互作用過程開辟了新的途徑。2015年，Benke等[74]將SM-FRET和微流控技術(shù)、雙聚焦熒光相關(guān)光譜和停-流圓二色等結(jié)合，詳細(xì)研究了另一種孔道形成毒蛋白（Bacterial cytolytic toxin ClyA）的組裝機(jī)制（圖3C）。他們?cè)诿恳粋€(gè)單體上修飾熒光供體（A488）和受體（A594），通過FRET效率及其它表征，提出了孔道形成的過程模型并推導(dǎo)出相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（圖3C）。該研究也說明，將SM-FRET和其它新技術(shù)結(jié)合起來可以深入研究許多生物學(xué)問題。最近，有研究者提出用多色SM-FRET研究多種蛋白之間的動(dòng)態(tài)相互作用過程[39]。

3.3 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究核酸分子構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化過程

核酸最基本的功能是作為生物體的遺傳信息載體，部分核酸分子還具有催化功能和調(diào)控功能[75]，直接觀測核酸分子的構(gòu)象動(dòng)態(tài)有助于理解核酸發(fā)揮功能的機(jī)制?；衾线B接體（Holliday junction）是基因重組過程中的重要中間體[76]，盡管傳統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)研究方法可以預(yù)測到霍利迪連接體能在兩種堆積異構(gòu)體之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，但是由于無法測得同步轉(zhuǎn)變過程，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)以及結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)信息無法獲得。McKinney等[41]在霍利迪連接體的兩端修飾熒光供體Cy3和受體Cy5（圖4A），首次直接觀測到單個(gè)霍利迪連接體在兩種構(gòu)象之間進(jìn)行轉(zhuǎn)變，發(fā)現(xiàn)霍利迪連接體構(gòu)象轉(zhuǎn)變的速率和DNA的序列﹑抗衡離子的種類﹑溫度等相關(guān)。同時(shí)他們獲得的動(dòng)力學(xué)信息提示霍利迪連接體的堆積構(gòu)象轉(zhuǎn)變和其分支的遷移存在聯(lián)系。該研究首次展示了SM-FRET在研究DNA結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)方面的巨大潛力。Joo等[77]利用SM-FRET技術(shù)發(fā)現(xiàn)了霍利迪連接體中少見的結(jié)構(gòu)種類以及離子對(duì)連接體的影響。 隨后，2005年，McKinney等[78]又觀察到了霍利迪連接體一步步自發(fā)地分支遷移的過程。很多生物過程包括基因重組都存在張力，為了能夠研究霍利迪連接體這個(gè)對(duì)力敏感的結(jié)構(gòu)在外力作用下的納米級(jí)微小變化，Hohng等將SM-FRET和光鑷技術(shù)相結(jié)合來觀測霍利迪連接體受到不同方向的拉伸力時(shí)的構(gòu)象變化[40]。如圖4B所示，霍利迪連接體的一端連在界面上，另一端通過一個(gè)長雙鏈DNA和磁珠連接，通過改變霍利迪連接體與長雙鏈DNA連接的位置可以在3個(gè)不同方向上施加< pN 的力（圖4C）。通過分析力的作用下霍利迪連接體上熒光對(duì)的FRET效率，分析霍利迪連接體構(gòu)象轉(zhuǎn)變的中間態(tài)，這與之前只能觀測到構(gòu)象轉(zhuǎn)變的終態(tài)相比是一個(gè)重大突破。

核酶（Ribozyme）是一類具有催化功能的核酸（DNA或RNA），其中RNA核酶相比于DNA核酶，種類和功能更加豐富，包括化學(xué)鍵的連接﹑結(jié)構(gòu)的折疊﹑以及催化等功能[75，79]。這些功能發(fā)揮的過程中表現(xiàn)出多種動(dòng)力學(xué)途徑和過渡態(tài)，利用單分子熒光技術(shù)研究這些復(fù)雜的過程能更直觀地得到每個(gè)RNA分子的結(jié)構(gòu)分布狀態(tài)以及實(shí)時(shí)的結(jié)構(gòu)變化信息，進(jìn)而更準(zhǔn)確地對(duì)其動(dòng)力學(xué)特征等進(jìn)行分析[79]。1999年，Ha等[42]首次利用SM-FRET研究核糖體中RNA分子的結(jié)構(gòu)變化。他們利用FRET效率的變化研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S15和Mg2+作用對(duì)三螺旋交聯(lián)的RNA分子構(gòu)象分布影響很大，尤其是Mg2+處于中間濃度時(shí)構(gòu)象表現(xiàn)出反常分布，這些構(gòu)象變化與核糖體功能直接相關(guān)。Nahas等[80]研究了發(fā)卡RNA核酶的催化過程，發(fā)現(xiàn)發(fā)卡RNA核糖酶的裂解動(dòng)力學(xué)和鍵合動(dòng)力學(xué)完全不同。另外，SM-FRET技術(shù)也使他們能夠在同一個(gè)分子上觀察到裂解和結(jié)合的多次循環(huán)，從而檢測到RNA分子在不同狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的速率。2007年，Hee等研究了金屬依賴的單個(gè)DNA核酶的折疊和催化性質(zhì)[43]，發(fā)現(xiàn)Zn2+和Mg2+可以引導(dǎo)DNA核酶折疊成更緊湊的結(jié)構(gòu)，以進(jìn)行催化裂解反應(yīng)。但是，當(dāng)Pb2+作為輔助因子時(shí)，DNA核酶則不需要提前折疊。

RNA是如何折疊成為天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)的的過程對(duì)于研究RNA的功能特征十分重要，但是對(duì)RNA折疊過程的研究卻大大落后于蛋白折疊的研究，這主要是因?yàn)镽NA的勢能圖比較復(fù)雜，對(duì)RNA折疊過渡態(tài)進(jìn)行表征更加困難[81]。Bokinsky等[81]利用SM-FRET實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)檢測發(fā)卡核酶在不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間的平衡轉(zhuǎn)換。如圖4D所示，研究模型是WTAC5發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA核酶，他們用FRET熒光基團(tuán)對(duì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的兩端進(jìn)行標(biāo)記，并在其中一端的不同鏈上修飾生物素，通過這種方法使其可以固定在界面上，以便更好地進(jìn)行單分子觀測。研究發(fā)現(xiàn)，金屬陽離子的加入，可以使RNA核酶的發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，熒光對(duì)之間的FRET效率也會(huì)發(fā)生改變。另外，隨著周圍溫度的改變，RNA核酶在兩種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的速率也會(huì)發(fā)生改變，他們還總結(jié)出了兩種狀態(tài)之間的自由能圖譜（圖4E）。Wilson等[82]同樣利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究了離子介導(dǎo)的RNA核酶折疊，在核酶結(jié)構(gòu)環(huán)的附近加入中間體后，其折疊速率提高500倍。Brenner等[83]研究了鳥嘌呤在核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)中的作用，為RNA調(diào)控基因表達(dá)提供了一個(gè)模型。最近，Uhm等[44]還利用SM-FRET研究了大腸桿菌硫胺素焦磷酸鹽核糖開關(guān)的共轉(zhuǎn)錄折疊動(dòng)態(tài)，Manz等[45]研究了S-腺苷甲硫氨酸核糖開關(guān)的能級(jí)。

3.4 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究蛋白質(zhì)-核酸動(dòng)態(tài)相互作用

DNA復(fù)制＼＼遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯等重要生物過程都存在蛋白與核酸的動(dòng)態(tài)相互作用。解旋酶在DNA復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，它可以利用ATP水解產(chǎn)生的能量解開DNA雙螺旋，很多疾病與之相關(guān)[84]。 2002年，Ha等[48]利用SM-FRET技術(shù)首次實(shí)時(shí)觀測了大腸桿菌解旋酶打開DNA雙鏈的啟動(dòng)和重啟過程。他們?cè)谟袉捂溕斐龅碾p鏈一端修飾熒光供體和受體（圖5A），通過FRET效率監(jiān)測解旋過程（圖5B）。結(jié)果表明，解旋酶的單體可以利用水解ATP產(chǎn)生的能量朝向單雙鏈連接處運(yùn)動(dòng)，但是解旋需要形成完整的解旋酶；而且解旋過程會(huì)暫時(shí)中斷和重新啟動(dòng)，這可能是由于解旋酶暫時(shí)脫離DNA然后又重新結(jié)合到DNA上開始工作。 Myong等[50]通過SM-FRET觀測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌解旋酶可以在DNA上面重復(fù)穿梭，能夠清楚地看到每一個(gè)單體可以利用ATP水解產(chǎn)生的能量在單鏈DNA上面發(fā)生移動(dòng)。解旋酶在DNA上遷移的過程中會(huì)驅(qū)動(dòng)DNA結(jié)合蛋白從DNA上解離，但是其中的機(jī)制難以說明；另外，解旋酶遷移時(shí)的步幅也未得到證明。2010年，Park等[85]以PcrA解旋酶為對(duì)象進(jìn)行SM-FRET觀測實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PcrA解旋酶會(huì)優(yōu)先在滯后鏈上移位，并使滯后鏈發(fā)生卷曲，形成高度重復(fù)的環(huán)形單鏈，這種結(jié)構(gòu)的形成使他們推測出PcrA解旋酶移位的步幅是一個(gè)核苷酸，同時(shí)使DNA發(fā)生卷曲要求PcrA解旋酶具有更開放的構(gòu)象，這種構(gòu)象可以快速除去結(jié)合在DNA上的RecA蛋白。

DNA復(fù)制過程中雙螺旋被打開后容易發(fā)生損傷， 修復(fù)損傷的過程中RecA蛋白扮演重要角色[86]。之前的研究[87]表明，RecA可與單鏈DNA結(jié)合形成螺旋形核酸-蛋白纖維，這種纖維促進(jìn)了基于同源重組的損傷修復(fù)，但是RecA與DNA結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程難以觀測。2006年，Joo等建立了一種基于SM-FRET的方法，能夠?qū)崟r(shí)觀測單個(gè)RecA蛋白與DNA結(jié)合和解離的過程（圖5C）[49]。利用基于隱馬爾科夫模型的分析方法，他們首次獲得了RecA纖維生長的動(dòng)力學(xué)信息（圖5D）。RecA蛋白催化同源重組的一個(gè)重要步驟是尋找同源雙鏈DNA， Ragunathan等利用基于SM-FRET的高時(shí)空分辨率成像方法對(duì)此過程進(jìn)行了觀測[88]。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了RecA蛋白纖維進(jìn)行同源檢索的滑動(dòng)模型，即RecA蛋白纖維會(huì)沿著雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，這種滑動(dòng)模式可以使檢索同源雙鏈DNA的速度提高200倍。

核糖體在細(xì)胞中負(fù)責(zé)將mRNA攜帶的信息翻譯成蛋白，是由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成的復(fù)合體[89]。實(shí)時(shí)觀測核糖體蛋白和RNA的組裝過程有助于理解核糖體功能結(jié)構(gòu)的形成。細(xì)菌的30S核糖體由21種蛋白在一條16S rRNA（核糖體RNA）通過層級(jí)組裝構(gòu)成[89]，其中核糖體蛋白S16 對(duì)于30S核糖體的后續(xù)組裝步驟十分關(guān)鍵，一個(gè)重要問題是前期蛋白的組裝對(duì)后續(xù)蛋白組裝的影響[51]。 2017年，Abeysirigunawardena等[51]利用三色SM-FRET研究了結(jié)合在16S的5'區(qū)域的核糖體蛋白S4﹑S17和S20促進(jìn)下一個(gè)蛋白（S16）進(jìn)入復(fù)合物的過程。如圖5E所示，他們?cè)?6S rRNA的螺旋3（Helix 3）上標(biāo)記Cy7，S4蛋白上標(biāo)記Cy5，S16、S17和S20蛋白上標(biāo)記Cy3，通過Cy5-Cy7和Cy3-Cy5的FRET信號(hào)監(jiān)測復(fù)合物的形成過程（圖5F）。他們發(fā)現(xiàn)S4和S20蛋白，而不是S4和S17蛋白，結(jié)合到16S rRNA后可以促進(jìn)S16蛋白的加入。S17和S20都能穩(wěn)定16S 5'區(qū)域的螺旋連接結(jié)構(gòu)，但是只有S20可以使16S rRNA的構(gòu)象能夠穩(wěn)定S16蛋白的加入。S16結(jié)合到16S rRNA上后，16S rRNA的結(jié)構(gòu)趨于松散，促進(jìn)了30S核糖體后續(xù)組裝過程。

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)被廣泛用于生命科學(xué)研究。 2016年，Singh等[57]首次用SE-FRET實(shí)時(shí)觀測了RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶識(shí)別靶標(biāo)DNA的過程。最近，有研究者利用SM-FRET 研究了CRISPR/Cas9系統(tǒng)中I-E型檢測復(fù)合物如何快速找到靶標(biāo)以及Cas9切割DNA時(shí)的構(gòu)象動(dòng)態(tài)[52，53，56]。

4 總結(jié)與展望

單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)已被成功用于研究許多重要的生物學(xué)過程，并取得了一些突破性的進(jìn)展， 但也有其自身的局限，如基于熒光分子間距離變化的共振能量轉(zhuǎn)移信號(hào)只能提供被標(biāo)記位點(diǎn)之間的距離變化信息，但是無法測量兩個(gè)位點(diǎn)沿著怎樣的軌跡產(chǎn)生距離變化，這種信息對(duì)于理解生物過程也很重要。未來可能需要發(fā)展單分子多色熒光共振能量轉(zhuǎn)移，同時(shí)結(jié)合晶體學(xué)數(shù)據(jù)和理論模擬進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以解決上述問題。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的另一個(gè)局限是無法測得生物過程的力學(xué)信息，這可能需要更多地與單分子操縱技術(shù)（如光鑷、磁鑷等）結(jié)合進(jìn)行研究。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)是學(xué)科交叉產(chǎn)生的技術(shù)，其自身的逐漸完善，以及更多地與其它技術(shù)聯(lián)合，必然可解決更多生物難題。

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Abstract Biomacromolecules participate in various kinds of vital processes. Observing and analyzing their structural dynamic and the dynamic processes of intermolecular interaction at molecular level is important for understanding the action mechanism. Since its advent， single molecular fluorescence resonance energy transfer （SM-FRET） has demonstrated its great potential in studying the conformational change and interaction process of biomacromolecules， and a series of new mechanisms have been revealed. This review summarized recent progresses of SM-FRET in studying protein structural dynamic， nucleic acid structural dynamic， protein-protein and protein-nucleic acid interactions.

Keywords Single molecular fluorescence resonance energy transfer； Biomacromolecule； Structural dynamic； Interaction； Review

（Received 1 March 2018； accepted 3 April 2018）