俞 晨，白小翠，黨二樂(lè)，王 剛

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院(西安 710032)

主題詞 銀屑病/中醫(yī)藥療法 芍藥苷/治療應(yīng)用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠

銀屑病俗稱(chēng)“牛皮癬”，是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，臨床以鱗屑性紅斑或斑塊為主要表現(xiàn)，我國(guó)是銀屑病“大國(guó)”，人群患病率約為0.5%，患者總數(shù)超過(guò)600 萬(wàn)[1]。該病確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為異常活化的角質(zhì)形成細(xì)胞與T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞在皮膚局部相互作用是銀屑病發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖既是疾病主要的病理改變，又是疾病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素[2-3]。銀屑病固有的長(zhǎng)久病程和易于反復(fù)，使其成為臨床難治的疾病之一，目前的治療方法在療效和安全性方面雖有優(yōu)勢(shì)，但也都還存在療效難以維持、不良反應(yīng)較多的問(wèn)題，令人不盡滿(mǎn)意[4-7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為銀屑病屬于“白疕”范疇，經(jīng)過(guò)后世醫(yī)家的傳承及發(fā)揮，形成從血論治、從臟腑論治、從邪論治等多種辨證施治的方法[8]，臨床實(shí)踐中體現(xiàn)了療法多樣、方藥豐富、劑型多種、副作用少等優(yōu)勢(shì)，在口服及外用中藥制劑的臨床療效觀察及實(shí)驗(yàn)研究等方面均取得了一定成績(jī)，尤其在提高療效、減少?gòu)?fù)發(fā)、降低副反應(yīng)及經(jīng)濟(jì)實(shí)用等方面優(yōu)勢(shì)明顯。在各類(lèi)型中藥復(fù)方中，白芍等清熱涼血類(lèi)藥物最為常用，我們的前期臨床研究也證實(shí)，以芍藥苷(Paeoniflorin, PF)為主要成分的白芍總苷(Total glucosides of paeonia，TGP)可有效改善中重度銀屑病癥狀?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實(shí)這類(lèi)藥物有效活性成分具有顯著且可靠的抗炎和抗增殖作用，并從參與銀屑病發(fā)病的免疫細(xì)胞紊亂角度解釋了TGP/PF治療銀屑病的作用機(jī)理，但對(duì)影響銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的作用仍不明確，限制了對(duì)單味中藥劑型及用法更有效地開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。本研究擬通動(dòng)物模型觀察外用芍藥苷對(duì)銀屑病表型的緩解及治療作用，以此初步探討芍藥苷對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的影響，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)芍藥苷在皮膚科的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 動(dòng)物模型制備及給藥 于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)12只體重30 g左右雌性近交系BALB/c小鼠，培養(yǎng)于本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)在恒溫恒濕的SPF級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)。隨機(jī)分為空白、IMQ造模、治療低劑量及高劑量四組。BALB/c小鼠耳部剃毛后，后三組小鼠連續(xù)7 d每天上午耳部涂抹250 mg∶12.5 mg咪喹莫特乳膏一次，制備咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型。治療組在建模過(guò)程中同時(shí)給小鼠耳部皮膚連續(xù)外用涂抹不同濃度的PF，低劑量組給予PF 10 μg/(次·鼠)，高劑量組給予PF1mg/(次·鼠)，觀察各組小鼠模型局部出現(xiàn)紅斑鱗屑后，進(jìn)行取材

2 實(shí)驗(yàn)藥品 芍藥苷原料由寧波朗生醫(yī)藥有限公司提供；咪喹莫特乳膏有英國(guó)3M Health Care Limited生產(chǎn)，注冊(cè)證號(hào)H2016007。

3 觀察方法 銀屑病樣小鼠模型外用芍藥苷治療對(duì)比分析：觀察小鼠大體變化，對(duì)比紅斑、鱗屑程度。將收集的小鼠皮損梯度酒精脫水，二甲苯透明后進(jìn)行HE染色，NDP.view軟件測(cè)量鼠耳表皮厚度，對(duì)比炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

結(jié) 果

1 四組小鼠表型比較 給予BALB/c小鼠連續(xù)外用咪喹莫特乳膏7 d進(jìn)行銀屑病建模，大體觀察耳部皮膚發(fā)現(xiàn)小鼠耳部變紅，增大，表面附有鱗屑，血管擴(kuò)張明顯。在建模過(guò)程中，同時(shí)給小鼠皮膚連續(xù)外用涂抹不同濃度的PF，低劑量組10μg/(次·鼠)及高劑量組1 mg/(次·鼠)，7 d后觀察小鼠表型，與IMQ組相比較，外用涂抹PF后小鼠紅斑鱗屑明顯減輕，表皮厚度明顯減輕(圖1)。

2 四組小鼠耳緣表皮厚度比較 通過(guò)測(cè)量耳緣厚度發(fā)現(xiàn)，空白組、咪喹莫特組、PF低劑量組及PF高劑量組的表皮厚度分別為0.27 mm、0.58 mm、0.52 mm、0.41 mm，治療組與咪喹莫特組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

3 四組小鼠皮膚組織病理檢查比較 將耳朵進(jìn)行皮膚組織病理檢查，HE染色顯示：與空白組相比，咪喹莫特組小鼠耳部出現(xiàn)角化不全、角化過(guò)度，表皮棘層增厚明顯，真皮淺層血管擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而兩組PF治療組均顯著的緩解了以上銀屑病的表型，真皮浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3)。

圖1 小鼠模型銀屑病表型(紅斑、鱗屑)變化

圖2 大體組織耳緣厚度變化

圖3 皮膚組織病理學(xué)改變( HE染色 ×10 )

4 四組小鼠組織病理表皮厚度比較 將病理切片中表皮厚度進(jìn)行量化發(fā)現(xiàn)空白組組、米喹莫特組、PF低劑量組及PF高劑量組的表皮厚度分別為15.54 μm、77.92 μm、40.86 μm、32.3 μm，芍藥苷治療組與米喹莫特組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖4)。

以上結(jié)果均提示外用PF能夠直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞緩解銀屑病表型，并且PF的治療作用隨劑量的增加而增強(qiáng)，從而達(dá)到治療銀屑病的作用。

圖4 組織病理表皮厚度

討 論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚未完全闡明，目前比較公認(rèn)的銀屑病的發(fā)病機(jī)制為，在皮膚應(yīng)激、損傷等誘因的作用下，遺傳易感性個(gè)體的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞被激活，激活的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)、產(chǎn)生多種免疫活性物質(zhì)[2]，這些免疫活性物質(zhì)通過(guò)介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)一步活化，或趨化、活化中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等固有免疫成分[3]，啟動(dòng)異常的免疫應(yīng)答并進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生異常的分化、活化。被活化的T細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)分泌大量細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-23和IL-17A等作用于表皮，進(jìn)一步激活角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)其增殖發(fā)生銀屑病的病理改變。

白芍總苷(Total glucosides of paeonia，TGP)是從中藥白芍中提取的有效成分，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷以及苯甲酰芍藥苷等，其中芍藥苷(Paeoniflorin, PF)占90%，是其主要有效成分。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TGP/PF的藥理作用展開(kāi)了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、止痛、保肝、調(diào)節(jié)免疫以及影響細(xì)胞增殖等多種藥理作用，被認(rèn)為是一種高效的抗炎免疫調(diào)節(jié)藥，在多個(gè)環(huán)節(jié)影響自身免疫性疾病(如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)的免疫細(xì)胞功能、抗原提呈過(guò)程和炎癥因子表達(dá)[9-10]。因此，TGP/PF被皮膚科醫(yī)生所認(rèn)可，并嘗試用于治療銀屑病、特應(yīng)性皮炎等免疫相關(guān)性慢性皮膚病的治療，臨床報(bào)道療效確切[11-12]。我們牽頭開(kāi)展的多中心、隨機(jī)、雙盲、平行對(duì)照臨床研究(ClinialTrials.gov 注冊(cè)登記號(hào): NCT02191020)發(fā)現(xiàn)，TGP聯(lián)合阿維A治療中重度斑塊狀銀屑病，在有效性和安全性方面均優(yōu)于單用阿維A治療，在明顯提高療效的同時(shí)還顯著降低了肝功能損害等不良反應(yīng)的發(fā)生[13]。

對(duì)于TGP/PF治療銀屑病的作用機(jī)理研究，目前多圍繞其免疫調(diào)節(jié)作用展開(kāi)。已有研究發(fā)現(xiàn)，①TGP/PF可明顯降低Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平[14-15]，抑制銀屑病動(dòng)物模型炎細(xì)胞浸潤(rùn)[16];②TGP/PF通過(guò)NF-κB和ERK通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生和白細(xì)胞遷移從而發(fā)揮抗炎作用[17];③TGP/PF可在體內(nèi)體外抑制血管新生[18]，從參與銀屑病發(fā)病的免疫細(xì)胞紊亂角度解釋了TGP/PF治療銀屑病的作用機(jī)理。目前針對(duì)TGP/PF作用于角質(zhì)形成細(xì)胞的研究較少。有學(xué)者報(bào)道[19-20]，TGP能明顯抑制INF-γ誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活力，同時(shí)明顯降低IL-23、VEGF等銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子的水平，提示TGP/PF可直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)揮其抗炎功能，但是其具體作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制尚不明確。

我們的研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手，嘗試使用芍藥苷外用涂抹于銀屑病模型小鼠，觀察其對(duì)銀屑病表型的緩解及治療作用，結(jié)果顯示外用PF能夠以劑量依賴(lài)性的方式有效緩解銀屑病樣表型，真皮浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞數(shù)量也受到明顯的抑制，提示芍藥苷可作用于銀屑病表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，抑制其異常增殖，從而達(dá)到治療銀屑病的作用。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)芍藥苷在皮膚科的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。其具體的作用靶點(diǎn)及調(diào)控信號(hào)通路機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。