張 健，張 偉2

1. 河南省開封市食品藥品檢驗(yàn)所(開封475000),2.黃河科技學(xué)院(鄭州450063)

主題詞 炮制(中藥) 補(bǔ)骨脂 補(bǔ)骨脂素 色譜法, 高壓液相 中藥化學(xué)成分

補(bǔ)骨脂有被稱為破故紙，婆固脂，胡韭子等，是一年生豆科直立草本植物，形態(tài)特征為單葉互生，葉寬卵形，花序腋生，花冠呈黃色或藍(lán)色，莢果呈卵形[1]。中醫(yī)以其干燥果實(shí)入藥，具有補(bǔ)腎壯陽、補(bǔ)脾健胃之功效，藥用價(jià)值較高[2]。骨質(zhì)疏松的臨床表現(xiàn)為骨骼疼痛、易骨折等，它是由多種原因?qū)е碌墓趋兰膊?，表現(xiàn)為單位體積內(nèi)骨組織量減少代謝性骨病變，而骨組織減少的原因主要是骨質(zhì)吸收增多[3-4]，大量臨床研究表明，補(bǔ)骨脂提取物中對(duì)增加骨組織有良好效果，可有效治療骨質(zhì)疏松癥[5-8]。中藥學(xué)研究表明，中藥成分在萃取過程中，易受到炮制方法的影響，在提取過程中，有效成分可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化或分解反應(yīng)，導(dǎo)致有效成分的流失[9]，本文通過對(duì)4種不同方法炮制的補(bǔ)骨脂提取物進(jìn)行含量分析，為中醫(yī)炮制補(bǔ)骨脂提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 儀 器 液相儀：配備有自動(dòng)進(jìn)樣器的美國Waters e2695高效液相色譜儀，2998型二極管陣列檢測(cè)器，均為美國Waters公司產(chǎn)品；天平：十萬分之一天平，量程0.01 mg～220 g，為德國Sartorius CP225D；超聲波清洗器：鄭州生元儀器有限公司SYV-22-600DTD；多功能粉碎機(jī)為上海兆申有限公司產(chǎn)品，型號(hào)XS-03。

2 試 劑 水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈均為色譜純(北京迪瑪歐泰科技發(fā)展中心產(chǎn)品)；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品均為中檢所對(duì)照品，扣除水分后純度均在95.0%以上；補(bǔ)骨脂藥材產(chǎn)自云南，經(jīng)外形對(duì)比和提取物鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂果實(shí)。炮制用酒為為黃酒(10.0±1.0)%，紹興吳越釀酒有限公司產(chǎn)品；炮制用鹽為中鹽，為中國鹽業(yè)總公司產(chǎn)品。

3 方 法

3.1對(duì)照品儲(chǔ)備液配制:用十萬分之一天平分別稱量補(bǔ)骨脂素對(duì)照品34.61 mg、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品33.63 mg、補(bǔ)骨脂定對(duì)照品35.13 mg、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品35.86 mg分別置于10 ml容量瓶中，加甲醇5 ml，冰域超聲30 min，待其冷卻至室溫后，使用甲醇定容搖勻得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

3.2 供試品配制

3.2.1 不同炮制方法:按照下述不同的炮制方法，每法平行制作3份樣品。鹽灸法(藥典法)：稱取干燥補(bǔ)骨脂果實(shí)100 g，經(jīng)0.1 g/ml鹽水浸泡4 h后，置于鐵鍋中，小火炒至膨脹、開裂，冷卻至室溫待用[10]。

3.2.1.1 雷公法：稱取干燥補(bǔ)骨脂果實(shí)100 g，加入適量炮制用酒，浸泡0.5 d后濾出，將補(bǔ)骨脂進(jìn)入與炮制用酒等量的清水中，浸泡3 d濾出后，置于蒸屜中蒸6 h，晾干待用[11]。

3.2.1.2酒浸法：稱取干燥補(bǔ)骨脂果實(shí)100 g，加入適量炮制用酒，浸泡0.5 d后濾出，置于鐵鍋中，小火炒至膨脹、開裂，冷卻至室溫待用[12]。

3.2.1.3 清炒法：稱取干燥補(bǔ)骨脂果實(shí)100 g，置于鐵鍋中，小火炒至膨脹、開裂，冷卻至室溫待用。

將冷卻后的藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩后即得樣品粉末。

3.2.2 供試品溶液配制:精密稱取補(bǔ)骨脂樣品粉末100 mg至100 ml容量瓶中，加入四分之一體積甲醇，冰域超聲30 min使溶解，冷卻至室溫后用甲醇定容搖勻得供試品儲(chǔ)備液。精密移取供試品儲(chǔ)備液5.0 ml至10 ml容量瓶中，使用50%甲醇水溶液定容搖勻，經(jīng)0.45μm尼龍濾膜過濾，即得供試品溶液。

3.3 色譜系統(tǒng):色譜儀為Waters e2695/2998型高效液相色譜儀。色譜柱：ACUITY UPLC BEH C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.7μm)。色譜條件：波長為246 nm、流速為0.4 ml/min、進(jìn)樣量為5μl、進(jìn)樣時(shí)間為30 min、柱溫為30 ℃。

3.4 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)：分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、3 ml置于同一5 ml容量瓶中，用甲醇定容搖勻，即得線性溶液。分別取上述不同濃度的線性溶液采用2.3中色譜系統(tǒng)進(jìn)樣，統(tǒng)計(jì)不同濃度下各成分的峰面積，計(jì)算各成分濃度(X)與峰面積(Y)的回歸方程，線性范圍和相對(duì)與補(bǔ)骨脂素的分離度，見表1。

表1 補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松型指標(biāo)的線性關(guān)系

結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松各成分(補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚)的線性關(guān)系良好，r值均≥0.9994，線性范圍較寬，各峰相對(duì)補(bǔ)骨脂定的分離度均>1.5。

3.5 精密度實(shí)驗(yàn)：日內(nèi)精密度為取樣品溶液按照2.3要求連續(xù)進(jìn)樣5針，測(cè)定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚峰面積RSD值，見表2。

3.5.1 日間精密度：每天進(jìn)2針樣品溶液，連續(xù)3 d共6針，測(cè)定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚峰面積RSD值，見表2。

表2 日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果(%)

結(jié)果顯示：經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定的補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松各成分(補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚)的日內(nèi)精密度和日間精高密度均良好。

3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):在配制樣品溶液完成后0 h、3 h、8 h、12 h、24 h分別按照3.3中色譜要求進(jìn)樣，測(cè)定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚峰面積RSD值，分別為1.21%、0.98%、1.05%和1.62%，均<2.0%，說明樣品溶液在配制后24 h內(nèi)是均一穩(wěn)定的。

3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取補(bǔ)骨脂粉末100 mg，按照3.2.2項(xiàng)下配制方法平行配制6份樣品溶液，按照3.3中色譜要求進(jìn)樣，測(cè)定6份樣品溶液中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚的峰面積RSD值，分別是0.59%、0.81%、0.57%和0.43%，表明HPLC高效液相法檢測(cè)補(bǔ)骨脂中各成分結(jié)果的重復(fù)性較好。

3.8 不同炮制方法檢測(cè)的含量結(jié)果比較：取不同炮制方法制成的平行3份樣品溶液，按照3.3中色譜要求進(jìn)樣，記錄3份樣品中峰面積的平均值，計(jì)算不同炮制方法下補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚的含量結(jié)果，見表3。

表3 不同炮制方法檢測(cè)的含量結(jié)果比較(mg/g)

3.9 不同炮制方法對(duì)各組分含量結(jié)果的影響：通過與生品提取物中各成分的比較，比較炮制方法對(duì)含量影響情況，見表4。

表4 不同炮制方法對(duì)各組分含量結(jié)果的影響(%)

本研究結(jié)果顯示，與生品比較，鹽灸法可提升補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量約1.49%、11.51%，但會(huì)造成4.29%的補(bǔ)骨脂定和0.45%的補(bǔ)骨脂酚流失。雷公法可提高補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量約19.52%和14.50%，但也造成9.51%的補(bǔ)骨脂定和9.98%的補(bǔ)骨脂酚含量降低。酒浸法可提高7.99%的補(bǔ)骨脂素和11.94%的異補(bǔ)骨脂素的含量，4.60%的補(bǔ)骨脂定和1.50%的補(bǔ)骨脂酚含量降低。清炒法對(duì)可提高2.35%的異補(bǔ)骨脂素和0.13%的補(bǔ)骨脂酚含量，降低1.67%的補(bǔ)骨脂素和29.45%的補(bǔ)骨脂定的含量。

討 論

補(bǔ)骨脂主要分布在云南西雙版納、四川金沙江河谷等地，在河北、山西、甘肅、安徽、江西、河南、廣東、廣西、貴州等省區(qū)有栽培，它喜暖潤濕氣候，喜肥沃之地。中醫(yī)以種子入藥，有壯陽補(bǔ)腎、固精縮尿、腎虛腰痛、小便頻數(shù)、小兒遺尿、腎漏、溫脾止瀉、納氣平喘的功效[13]。有多種中醫(yī)處方中均有此藥，它主治腎虛陽痿、腰膝酸軟冷痛、腎虛遺精、遺尿或因脾腎陽虛所致的腹瀉以及甚虛體寒之癥[14]。

補(bǔ)骨脂提取物中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及補(bǔ)骨脂定均為香豆素類化合物，補(bǔ)骨脂酚為單萜酚類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)骨脂提取物各種成分均為光敏性化合物，服用后均需輔以日光或者紫外線照射，才能發(fā)揮其藥效[15]。補(bǔ)骨脂素有光敏、抗癌和止血及舒張平滑肌的作用。胡中花等[16]研究表明，補(bǔ)骨脂素能促E S F-1細(xì)胞的分裂和生長，能促進(jìn)膠原蛋白的合成，表現(xiàn)為潛在的抗皮膚衰老作用異補(bǔ)骨脂素不僅有植物激素樣作用，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分裂和轉(zhuǎn)化。朱振標(biāo)等[17]研究表明，異補(bǔ)骨脂素可減少小鼠因摘除卵巢引起的股骨下段脂肪細(xì)胞增多，且能顯著改善其因摘除卵巢而引起股骨下段骨量的丟失。補(bǔ)骨脂定有抗真菌的作用，李靜等[18]研究表明，在抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)骨脂定可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長分裂作用。補(bǔ)骨脂酚對(duì)膽汁運(yùn)轉(zhuǎn)有積極作用，畢亞男等[19]研究表明，補(bǔ)骨脂酚補(bǔ)骨脂酚能增加鈉牛磺酸膽酸共轉(zhuǎn)移蛋白的含量，且連續(xù)給藥兩周也不會(huì)對(duì)小鼠肝臟造成毒性作用。

本研究中高效液相電子圖譜結(jié)果表明，異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚相對(duì)補(bǔ)骨脂素峰的分離度均>1.5，說明各峰分離良好，彼此峰面積之間無影響。所得補(bǔ)骨脂各提取物濃度和峰面積的回歸方程中，異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚的r值均大于0.9994，說明濃度和峰面積的擬合度高，提示兩者的線性關(guān)系良好。此外，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚日內(nèi)精密度中峰面積RSD均<0.20%，日間精密度中峰面積RSD<2.0%，各成分在室溫下24h的峰面積RSD<2.0%，且重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中峰面積RSD均<2.0%，這說明提取物中各成分的濃度相對(duì)穩(wěn)定，高效液相色譜法在測(cè)定補(bǔ)骨脂中各成分峰面積結(jié)果準(zhǔn)確。這些實(shí)驗(yàn)都是為了保證后續(xù)各成分峰面積測(cè)量的準(zhǔn)確性，保證含量計(jì)算結(jié)果可信度。

在建立良好的線性關(guān)系，并確定計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確可靠后，本研究將四種不同的炮制方法制得的產(chǎn)品經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，不同的方法對(duì)補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松成分有著不同的影響。本研究結(jié)果顯示，雷公法可顯著提高補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量水平；酒浸法可明顯提高補(bǔ)骨脂定含量水平、清炒法則對(duì)補(bǔ)骨脂酚的含量有較大的提升作用。大量研究表明，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)促進(jìn)骨細(xì)胞的生長分裂，降低骨量減少有積極作用，因此雷公法較其他炮制方法而言更好，對(duì)抗骨質(zhì)疏松性指標(biāo)性成分有較大的提升作用，趙根華等[20]研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷經(jīng)雷公法炮制過程中會(huì)部分轉(zhuǎn)化成補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，這也佐證了本研究結(jié)果。

綜上所述，雷公法在炮制補(bǔ)骨脂過程中，對(duì)提取物中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量的提升作用較為明顯，在中醫(yī)應(yīng)用中有積極意義。不足之處是在著作《雷公炮制法》中并未明確說明使用何種酒浸泡，不同酒可能對(duì)補(bǔ)骨脂中成分的影響不同，后續(xù)可探討使用不同濃度的酒進(jìn)行雷公炮制法對(duì)補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松成分的影響。