杜 霞，李鶴鳴，陳志永，郭 冬，王春柳，李 曄

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安710003)

主題詞 腎疾病 纖維化 @補(bǔ)腎活血方 藥理學(xué) 分子藥理作用機(jī)制

慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)目前已經(jīng)成為全球性公共健康問(wèn)題。據(jù)國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)和國(guó)際腎臟基金會(huì)聯(lián)盟的估計(jì)，慢性腎臟病患者占世界人口的十分之一。腎纖維化(Renal fibrosis, RIF)是一個(gè)龐雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及了腎的幾乎所有細(xì)胞，是各種不同病因的慢性腎病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。了解治療腎纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，研究腎纖維化的分子機(jī)制、探索有效的干預(yù)措施是當(dāng)前慢性腎臟病的研究熱點(diǎn)[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是應(yīng)用血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)受體阻斷劑、骨形成蛋白-7(BMP-7)增效劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)等治療措施抗腎纖維化，但效果并不理想[2]。

近年來(lái)，中醫(yī)藥治療腎臟病具有明顯優(yōu)勢(shì)，其在防治RIF方面具有良好的應(yīng)用前景。補(bǔ)腎活血方是一種被廣泛使用的經(jīng)典的傳統(tǒng)中藥方劑，由黃芪、丹參、大黃、菟絲子和莪術(shù)5味藥材組成。它有滋陰補(bǔ)腎，調(diào)節(jié)子宮功能和促進(jìn)血液循環(huán)等作用，在改善和治療腎臟疾病方面有著明顯的治療效果，已經(jīng)被多次用于研究腎病相關(guān)的各種疾病中。例如：段曉虹等研究了補(bǔ)腎活血方對(duì)慢性腎炎腎虛血瘀癥患者尿蛋白、尿IL-6、TGF-β1及MCP-1的影響，結(jié)果表明該復(fù)方可通過(guò)下調(diào)體內(nèi)IL-6、TGF-β1及MCP-1減輕尿蛋白[3]；郭家安等觀察了補(bǔ)腎活血方治療早期糖尿病腎病的臨床療效，通過(guò)對(duì)100例早期糖尿病腎病患者進(jìn)行臨床觀察發(fā)現(xiàn)該方劑治療早期糖尿病腎病療效顯著，安全性較高[4]。盡管，補(bǔ)腎活血方在改善和治療腎臟疾病方面有著明顯的臨床療效，但是由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，中藥用藥又多以實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為指導(dǎo)，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究不夠深入，對(duì)其作用機(jī)理不夠清楚，從而導(dǎo)致無(wú)法在經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)更好的候選藥物。

本論文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用ADME性質(zhì)篩選、靶標(biāo)識(shí)別、網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析及KEGG通路分析預(yù)測(cè)補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的藥效活性成分，構(gòu)建該方劑“藥效成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，并闡釋中藥方劑補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的作用機(jī)制，為中藥方劑藥理機(jī)制的理解提供新的方法和視角，也為今后治療腎纖維化藥物的開(kāi)發(fā)奠定良好的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 補(bǔ)腎活血方化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立 補(bǔ)腎活血方由黃芪、丹參、大黃、菟絲子和莪術(shù)5味藥材組成，采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[5](Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)及文獻(xiàn)挖掘，對(duì)各味藥材所含化學(xué)成分進(jìn)行收集，建立補(bǔ)腎活血方化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

2 ADME篩選潛在活性成分 借助計(jì)算機(jī)輔助ADME性質(zhì)預(yù)測(cè)對(duì)祛瘀生新膠囊潛在活性成分群進(jìn)行初篩。采用王永華等人建立的obioavail 1.1和preCaco2預(yù)測(cè)模型對(duì)所有化學(xué)成分的口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)和Caco-2進(jìn)行計(jì)算并初步篩選潛在活性成分群，閾值采用文獻(xiàn)報(bào)道的OB ≥ 30%和Caco-2 ≥ -0.40[6-7]。

3 靶標(biāo)識(shí)別及疾病關(guān)聯(lián) 采用基于隨機(jī)森林和支持向量機(jī)算法發(fā)展建立的靶標(biāo)預(yù)測(cè)模型[8]對(duì)所有潛在活性成分的靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，由UniProt (Universal protein)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取所有靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的基因信息，然后，通過(guò)查找TTD (Therapeutic target database)和CTD(Comparative toxicogenomics database)等生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)將靶標(biāo)映射在腎纖維化及其相關(guān)疾病上，從而得到補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的每味藥材的活性成分及對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)。

4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 基于上述獲得的藥材、活性成分及靶標(biāo)信息，采用Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行 “藥材-活性成分-靶標(biāo)” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并利用該軟件中的network analyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)進(jìn)行分析，如：度(Degree)、介數(shù)中心度(Betweenness centrality)和緊密中心度(Closeness centrality)等。

5 KEGG通路富集分析 采用在線分析工具DAVID (The database for annotation, visualization and integrated discovery)進(jìn)行KEGG通路富集分析，確定補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化疾病的分子作用機(jī)制。

結(jié) 果

1 補(bǔ)腎活血方化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)挖掘方式共搜集了491個(gè)化學(xué)成分，其中，黃芪87個(gè)，丹參202個(gè)，大黃92個(gè)，菟絲子29個(gè)，莪術(shù)81個(gè)。

2 ADME篩選潛在活性成分 采用obioavail 1.1和preCaco2兩種預(yù)測(cè)模型分別對(duì)上述491個(gè)化合物的OB和Caco-2進(jìn)行了計(jì)算，188個(gè)化合物由于具有較好的ADME性質(zhì)被作為潛在活性成分保留用于后續(xù)的研究。其中，黃芪28個(gè)，丹參95個(gè)，大黃18個(gè)，菟絲子19個(gè)，莪術(shù)43個(gè)。

3 靶標(biāo)識(shí)別與疾病關(guān)聯(lián) 采用上述靶標(biāo)預(yù)測(cè)模型對(duì)188個(gè)潛在活性成分進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別，并將所有靶標(biāo)映射到TTD和CTD兩個(gè)疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，以 “inflammation”、“kidney”、“renal”、“faibrosis”、“neph-”、“adrenal”等關(guān)鍵詞為檢索目標(biāo)，對(duì)潛在活性成分和靶標(biāo)進(jìn)行再次篩選，最終獲得136個(gè)活性成分及其對(duì)應(yīng)的59個(gè)靶標(biāo)。補(bǔ)腎活血方中存在一個(gè)化合物與多個(gè)靶標(biāo)之間作用，也存在有不同化合物共同作用于一個(gè)靶標(biāo)的現(xiàn)象，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分多靶標(biāo)的作用機(jī)制，針對(duì)腎纖維化等復(fù)雜疾病，中藥無(wú)疑是較好的多靶標(biāo)藥物的重要開(kāi)發(fā)來(lái)源。

4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 補(bǔ)腎活血方“藥材-化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)共包含有200個(gè)節(jié)點(diǎn)，紫色三角形點(diǎn)表示藥材有5個(gè)，黃色方形點(diǎn)表示化合物有136個(gè)，藍(lán)色圓形點(diǎn)表示靶標(biāo)有59個(gè)，邊一共有659條，分別表示了藥材和化合物或化合物和靶標(biāo)之間的聯(lián)系(見(jiàn)圖1)。利用Cytoscape 3.6.1得到網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)，以度、介數(shù)中心度和緊密中心度為依據(jù)對(duì)化合物和靶標(biāo)分別進(jìn)行篩選，得到3項(xiàng)數(shù)值均在平均值以上的關(guān)鍵化合物19個(gè)和關(guān)鍵靶標(biāo)5個(gè)，見(jiàn)表1和表2。在這些關(guān)鍵化合物中，度值大于10的有槲皮素、山柰酚、異鼠李素、木犀草素、β-谷甾醇，其中槲皮素(quercetin，degree = 65，betweenness centrality = 0.1828，closeness centrality = 0.4901)和山柰酚(kaempferol，degree = 26，betweenness centrality = 0.0241，closeness centrality = 0.4403)的度值遠(yuǎn)高于其他化合物，槲皮素和山柰酚同屬黃酮類化合物，均在文獻(xiàn)中被證明對(duì)炎癥引起的腎纖維化及糖尿病腎病等疾病發(fā)揮作用。槲皮素可顯著抑制系膜細(xì)胞增殖[9]，使系膜細(xì)胞維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，從而抑制多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)分泌導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量生成和多種炎性細(xì)胞的聚集，阻斷腎小球炎癥的發(fā)展，還可以抑制細(xì)胞分化以及TGF-β信號(hào)通路等發(fā)揮抗纖維化的作用，并且槲皮素在糖尿病腎病方面也有大量的研究[10]；山柰酚能夠通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞增殖在糖尿病腎病起到較好的作用[11]。

位于所有靶標(biāo)degree排名的前兩個(gè)靶標(biāo)為前列腺素 G/H 合成酶 2(PTGS2，degree = 135，betweenness centrality = 0.4646，closeness centrality = 0.6546)和前列腺素 G/H 合成酶 1(PTGS1，degree = 88，betweenness centrality = 0.1762，closeness centrality = 0.0596)，分別與135個(gè)化合物和88個(gè)化合物相關(guān)聯(lián)，大黃、丹參、黃芪、菟絲子、莪術(shù)均對(duì)這兩個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮作用，由此可知PTGS2和PTGS1是在治療腎纖維化及其相關(guān)疾病的過(guò)程中非常重要的靶標(biāo)，在文獻(xiàn)中也有證實(shí)。PTGS2和PTGS1是前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)的兩種同工酶，兩者與腎臟的炎癥反應(yīng)和纖維化都具有一定的關(guān)系，PTGS2屬即刻早期基因，當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激時(shí)，PTGS2的表達(dá)上調(diào)，催化花生四烯酸產(chǎn)生多種前列腺素(PGs)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)及抗纖維化等一些作用[12]。其他靶標(biāo)如：β-腎上腺素能受體在調(diào)節(jié)腎臟鈉分泌以及血管舒張方面發(fā)揮作用，其基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)[13]，腎臟為高血壓損害的靶器官，高血壓腎病為高血壓的嚴(yán)重并發(fā)癥[14]，β2-腎上腺素能受體(β2-adrenergic receptor，ADRB2)編碼區(qū)的上游1023 位點(diǎn)的5’-調(diào)控區(qū)部分序列單核苷酸多態(tài)性與嚴(yán)重的高血壓有關(guān)[15]。

表1 補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的關(guān)鍵活性成分的ADME性質(zhì)及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

表2 補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的關(guān)鍵靶標(biāo)信息及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

序號(hào)靶標(biāo)名稱UniProt ID基因名稱度介數(shù)中心度緊密中心度1Prostaglandin G/H synthase 2P35354PTGS21350.65460.46462Prostaglandin G/H synthase 1P23219PTGS1880.50770.17623Beta-2 adrenergic receptorP07550ADRB2550.43260.05964mRNA of PKA Catalytic Subunit C-alphaP17612PRKACA270.37830.01445Peroxisome proliferator activated receptor gammaP37231PPARG270.37410.0184

5 KEGG通路富集分析 59個(gè)靶標(biāo)共富集在76條通路上，其中，19條與腎纖維化及其相關(guān)疾病有關(guān)。圖2為補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的KEGG通路分析結(jié)果，從圖中可以看出，補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化及其相關(guān)疾病的通路主要有PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路等，補(bǔ)腎活血方中的有效成分通過(guò)作用于這些信號(hào)通路來(lái)達(dá)到治療疾病的目的。糖尿病腎病是最常見(jiàn)并且最嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，繼而會(huì)演變成腎臟的纖維化，PI3K-Akt信號(hào)通路就與糖代謝的調(diào)控發(fā)揮一定的作用，PI3K-Akt信號(hào)通路與補(bǔ)腎活血方相關(guān)的靶標(biāo)數(shù)量最多，有11個(gè)，分別為MET、RELA、COL1A1、EGF、INS、IL2、NOS3、PTEN、SPP1 TP53、MYC，補(bǔ)腎活血方通過(guò)對(duì)作用于PTEN，催化PIP3，其轉(zhuǎn)換為PIP2，抑制PE3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及干擾糖代謝，在葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程中，PTEN能調(diào)控Akt的活性而發(fā)揮作用[16]。

腎組織的炎癥反應(yīng)以及腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等相關(guān)的組織損傷，都是導(dǎo)致慢性腎病發(fā)展到終末期腎病的重要因素，p38MAPK信號(hào)通路是抗炎藥物干預(yù)腎組織炎癥性損傷中比較經(jīng)典的途徑，MAPK信號(hào)通路中與補(bǔ)腎活血方相關(guān)的靶標(biāo)數(shù)量為8個(gè)，分別是RELA、EGF、HSPB1、MAPK14、PRKCB、PRKACA、TP53、MYC，其中MAPK14是 P38MAPK的同型異構(gòu)體，幾乎在所有組織中都有表達(dá)，p38MAPK被活化后，進(jìn)去細(xì)胞核調(diào)節(jié)各種核轉(zhuǎn)錄因子，例如環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件連接蛋白，轉(zhuǎn)錄激活因子，NF-κB等基因的生物活性[17]，包括NF-κB蛋白家族中的一個(gè)亞型p65(RELA，NF-κB3)。補(bǔ)腎活血方中多種化學(xué)成分都對(duì)RELA表達(dá)產(chǎn)生影響，通過(guò)抑制腎組織中p38MAPK磷酸化、NF-κB 蛋白表達(dá)水平，從而減少炎癥反應(yīng)，改善腎組織損害[18-19]。

慢性缺氧以及腎小管損傷同樣作為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的原因，HIF-1信號(hào)通路[20]就與這一機(jī)制有關(guān)，HIF-1上相關(guān)靶標(biāo)為RELA、TIMP1、EDN1、EGF、INS、NOS3、PRKCB，HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于人體應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子，與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)，糖尿病組織慢性缺氧狀態(tài)下HIF-1α表達(dá)明顯增強(qiáng)[21]，補(bǔ)腎活血方中化學(xué)成分通過(guò)影響作為關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子的NF-κB，調(diào)控下游的HIF-1α，來(lái)影響HIF-1α在炎癥中的作用[22]。

討 論

本論文采用ADME性質(zhì)篩選、靶標(biāo)識(shí)別、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及通路分析的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，首次對(duì)補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制進(jìn)行了闡述，共獲得19個(gè)關(guān)鍵藥效成分和5個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，并通過(guò)KEGG通路分析獲得3條主要作用通路。本研究充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)、多通路的作用特點(diǎn)，為補(bǔ)腎活血方治療腎纖維化的藥效物質(zhì)及潛在作用機(jī)制研究提供了一種新的研究思路，為該方劑的進(jìn)一步升級(jí)改造及臨床研究提供了必要的理論依據(jù)。