王家妮 明 建,2 田 勇 王榮杰 李福香

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2. 西南大學(xué)國家食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)中心，重慶 400715)

昆侖雪菊學(xué)名兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)[1]，系菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)一年生草本植物，因其生長在新疆昆侖山脈海拔3 000 m以上的高寒積雪地區(qū)而得名“雪菊”[2]。研究表明，昆侖雪菊含有黃酮、有機酸、皂苷、鞣質(zhì)、不飽和脂肪酸、三萜類、多肽類等多種活性成分[3-4]，其中黃酮類化合物含量最為豐富[5]。昆侖雪菊黃酮具有抗氧化[6-7]、降血脂[8]、降血糖[9]、抗炎[10]、降血壓[11]和抗衰老[12]等多種生物活性。

目前，國內(nèi)外對昆侖雪菊黃酮類化合物的提取主要采用有機溶劑法[13-14]，鮮有用水直接浸提的研究報道。但在日常生活中，雪菊的主要攝入方式為傳統(tǒng)茶飲，因此更應(yīng)當(dāng)關(guān)注其親水活性成分。李寶文等[15]研究了昆侖雪菊中水溶性黃酮的提取工藝，其提取方法不同于傳統(tǒng)茶飲沖泡，而模擬傳統(tǒng)茶飲沖泡方式，更具有實際價值。因此，本研究模擬傳統(tǒng)茶飲沖泡方法，對昆侖雪菊茶總黃酮進行水浸提，通過響應(yīng)面法優(yōu)化浸提工藝，并對昆侖雪菊茶總黃酮的體外抗氧化活性進行研究，以期為昆侖雪菊茶飲的開發(fā)及研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊：采自新疆昆侖山海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，購于新疆和田地區(qū)；

蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、熒光素鈉鹽(FL)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)：分析純，美國Sigma公司；

2,2′-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽(ABAP)：分析純，日本W(wǎng)ako Chemicals公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計：JH722型，上海精科科學(xué)儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，常州澳華儀器有限公司；

分析天平：FA1004A型，上海精天電子儀器有限公司；

pH計：PB-10型，德國賽多利斯公司；

微型臺式離心機：1-15PK型，德國賽多利斯公司；

多功能酶標儀：Syhergy H1型，美國基因公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

(1) 浸提時間：精確稱取3.0 g昆侖雪菊樣品放入三角瓶中，按料液比1∶80 (g/mL)與水混合，在90 ℃下分別浸提2，5，8，11，14，17 min，測定浸提時間對總黃酮得率的影響。

(2) 浸提溫度：精確稱取3.0 g昆侖雪菊樣品放入三角瓶中，按料液比1∶80 (g/mL)與水混合，分別在75，80，85，90，95，100 ℃下浸提14 min，測定浸提溫度對總黃酮得率的影響。

(3) 料液比：精確稱取3.0 g昆侖雪菊樣品放入三角瓶中，分別按料液比1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100 (g/mL)，在90 ℃條件下浸提14 min，測定料液比對總黃酮得率的影響。

1.3.2 雪菊茶總黃酮含量測定

(1) 標準曲線的制備：參照文獻[16]。得到標準曲線的回歸方程：Y= 0.012 7x-0.011 4(R2=0.999 7)。

(2) 樣品黃酮含量的測定：取1 mL茶湯樣品(可作適當(dāng)稀釋)，置于25 mL容量瓶中，后續(xù)操作與標準曲線制備相同。

1.3.3 雪菊茶總黃酮得率計算

(1)

式中：

c——提取率，%；

m1——提取的總黃酮質(zhì)量，g；

m2——干燥原料的質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化浸提工藝 結(jié)合單因素試驗結(jié)果，對雪菊茶總黃酮浸提工藝進行響應(yīng)面試驗設(shè)計及回歸方程方差分析。以總黃酮得率為響應(yīng)值，浸提時間、浸提溫度、料液比作為考察因素，選取5個中心點進行17個試驗，并對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析。

1.3.5 昆侖雪菊茶抗氧化活性測定

(1) 清除DPPH·能力：根據(jù)Cheung等[17]的方法。按式(2)計算DPPH·清除能力。

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

Ai——樣品液吸光度；

Aj——純水吸光度。

(2) 鐵還原能力測定(FRAP)：根據(jù)Luanda等[18]的方法。

(3) 氧自由基吸收能力測定(ORAC)：根據(jù)Wolfe等[19]的方法。按式(3)、(4)分別計算AUC值和ORAC值。

AUC=(0.5×f1/f1+f2/f1+f3/f1+……+fn/f1+……+f30/f1+0.5×f30/f1)×CT，

(3)

(4)

式中：

f1——第1次熒光讀數(shù)；

fn——第n次熒光讀數(shù)；

CT——間隔測定時間4.5 min；

AUC樣品——樣品熒光衰減下的面積；

AUC空白——空白液熒光衰減下的面積。

用Trolox當(dāng)量(μmol TE/g)來表示ORAC值。

1.4 試驗數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010計算平均值和標準偏差，Origin 8.0軟件進行單因素試驗分析，響應(yīng)面試驗設(shè)計與方差分析使用Design-Expert 8.0.6軟件進行。所有試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 浸提時間對昆侖雪菊茶總黃酮得率的影響 由圖1可知，在2～11 min時雪菊茶總黃酮得率隨浸提時間的增加而增加，超過11 min以后基本保持不變。分析其原因可能是昆侖雪菊中黃酮隨著浸提時間的延長不斷溶出，當(dāng)時間達到11 min時，雪菊中黃酮基本溶出，此后隨著浸提時間的延長，總黃酮得率不再變化。因此選擇最佳浸提時間為11 min。

圖1 浸提時間對昆侖雪菊茶總黃酮提取的影響

Figure 1 Effect of extraction time on the yield of flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

2.1.2 浸提溫度對昆侖雪菊茶總黃酮得率的影響 由圖2可知，在一定溫度范圍內(nèi)，昆侖雪菊茶總黃酮得率與浸提溫度呈正相關(guān)，當(dāng)浸提溫度達到95 ℃時，總黃酮得率達到最大值18.22%，當(dāng)溫度高于95 ℃雪菊茶總黃酮得率有所下降。因此選擇最佳浸提溫度為95 ℃。

2.1.3 料液比對昆侖雪菊茶總黃酮得率的影響 由圖3可知，隨著加水量的增加，昆侖雪菊茶總黃酮得率呈先增加后減少的趨勢，在料液比為1∶80 (g/mL)時總黃酮得率達到最大值，與宋佳敏等[20-21]研究結(jié)果一致。這可能是當(dāng)加水量較少時，在稀釋作用下黃酮隨著提取液的增加溶出更加充分，但加水量太大會導(dǎo)致體系的比熱容增大，可能會加劇對黃酮結(jié)構(gòu)的破壞[21]。因此選擇最佳料液比為1∶80 (g/mL)。

圖2 浸提溫度對昆侖雪菊茶總黃酮提取的影響

Figure 2 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

圖3 料液比對昆侖雪菊茶總黃酮提取的影響

Figure 3 Effect of material-to-liquid ratio on the flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對昆侖雪菊茶總黃酮得率有影響的浸提時間、浸提溫度、料液比因素，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗。表1為因素水平編碼表，表2為試驗方案設(shè)計及結(jié)果。

表1 設(shè)計試驗因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of Box-Behnken design

使用Design Expert 8.0.6軟件，對表2中數(shù)據(jù)進行處理，得到如表3所示的該模型回歸方程方差分析表，對數(shù)據(jù)進行非線性回歸的二項式擬合，得到以下預(yù)測模型：

R=19.86+0.76A+0.71B+0.21C+0.12AB-0.21AC-0.14BC-0.61A2-0.79B2-0.17C2。

(5)

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design-expert design scheme and experimental results

從表3可以看出，3個因素的一次項及二次項對總黃酮得率的影響極顯著(P<0.01)，3個因素之間交互作用均顯著(P<0.05)。由F值可知，各因素對昆侖雪菊茶總黃酮得率影響的大小次序依次為：浸提時間>浸提溫度>料液比。

表3 優(yōu)化后模型方差分析表?Table 3 Significance test for coefficient of the regression model developed

? **表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(0.01

2.2.2 響應(yīng)面分析 圖4可以直觀地反映出浸提時間、浸提溫度和料液比三因素之間的交互作用對總黃酮得率的影響。各因素對總黃酮得率的影響程度可以通過響應(yīng)曲面陡峭程度反映，響應(yīng)曲面陡峭表明對總黃酮得率影響顯著，響應(yīng)曲面平緩，表明該因素對總黃酮得率影響不顯著[22]。比較模型的響應(yīng)曲面陡峭程度：浸提時間>浸提溫度>料液比，表明各因素對總黃酮提取率的影響大小順序為：浸提時間>浸提溫度>料液比，其結(jié)論同表3方差分析結(jié)論一致。等高線的形狀可反映出各因素間交互作用的強弱，趨于橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，而圓形表明不顯著[23]，圖4(a)～(c)中各因素相互作用得到的等高線均為橢圓形，表明浸提時間與浸提溫度、浸提時間與料液比、浸提溫度與料液比交互作用顯著，與模型的方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)浸提工藝條件的驗證 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件，結(jié)合實際操作條件，響應(yīng)面優(yōu)化的模型得出最優(yōu)條件為：浸提時間13 min、浸提溫度98 ℃、料液比1∶78 (g/mL)，提取率為20.30%。根據(jù)優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)提取，驗證實驗重復(fù)3次，取平均值，黃酮得率為(20.39±0.07)%，與預(yù)測模型得出的理論值相比較，偏差<0.33%，說明該模型具有可靠性，可以用于預(yù)測昆侖雪菊茶浸提總黃酮得率。

2.3 雪菊茶的體外抗氧化活性評價

如圖5所示，昆侖雪菊茶DPPH·清除能力的半數(shù)有效濃度值(IC50)為(82.40±1.98) μg/mL，弱于抗壞血酸的[(18.70±0.89) μg/mL]；鐵還原力IC50值為(137.98±1.56) μg/mL，弱于抗壞血酸的[(60.41±0.62) μg/mL]，表明昆侖雪菊茶具有一定的鐵還原能力及抗氧化活性。同時，研究發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊茶的ORAC值為1 427.89 μmol TE/g·DW，顯著高于徐維盛等[24]測定的閔紅茶(1 379.10 μmol TE/g·DW)、烏龍茶(1 270.70 μmol TE/g·DW)以及古丈毛尖茶(1 247.10 μmol TE/g·DW)，表明昆侖雪菊茶具有良好的氧自由基清除能力。

圖4 等高線及響應(yīng)曲面圖Figure 4 Contour plots and response surface

圖5 昆侖雪菊茶抗氧化能力Figure 5 Antioxidant Capacity of Coreopsis tinctoria tea

3 結(jié)論

本研究通過模擬日常沖泡花茶的方法，以昆侖雪菊茶總黃酮浸出得率為評價指標，采用單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化昆侖雪菊茶浸提總黃酮的最佳工藝條件，并評價其體外抗氧化活力。工藝優(yōu)化結(jié)果表明，最佳浸提條件為：浸提時間13 min、浸提溫度98 ℃、料液比1∶78 (g/mL)，該條件下昆侖雪菊茶中總黃酮得率高達20.30%，以數(shù)學(xué)模型得到的浸提條件進行驗證實驗，相對誤差較小(RSD<0.33%)，表明回歸模型優(yōu)化得到的浸提工藝條件是有效的，具有實用價值。

另外，昆侖雪菊茶黃酮的抗氧化活性研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，昆侖雪菊茶抗氧化能力隨總黃酮濃度的增加而增加，且線性關(guān)系良好。昆侖雪菊茶的清除DPPH·IC50值為(82.40±1.98) μg/mL，還原鐵離子的IC50值為(137.98±1.56) μg/mL，ORAC值為1 427.89 μmol TE/g·DW，表明昆侖雪菊茶表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑來源，具有良好的發(fā)展前景。

本研究以水為溶劑，采用傳統(tǒng)茶飲沖泡方式，更具有實際意義。本文僅研究了昆侖雪菊茶中總黃酮的浸提工藝條件及體外抗氧化活性，而昆侖雪菊茶飲中總黃酮的開發(fā)利用及抗氧化有效單體成分有待進一步研究。