張東峰 劉 琪 張欣悅 付鑫景 張佳琦 陸 俊,3

(1. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

食用花卉是指能夠直接利用花朵或花的葉食用的植物[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)食用花卉的現(xiàn)狀與前景已有一定的研究[2]，現(xiàn)證實(shí)，食用花卉中含有96種可供人體吸收的物質(zhì)，包括多種營(yíng)養(yǎng)素、活性蛋白酶和多酚化合物等活性物質(zhì)[3-4]，其中多酚主要有酚酸、黃酮和花色苷[5-6]等。食用花卉萬(wàn)壽菊，具有祛風(fēng)降火，化痰止咳，平肝清熱的功效，其主要酚酸類(lèi)物質(zhì)包括原兒茶素、綠原酸、沒(méi)食子酸和阿魏酸[7]。 Kaisoon等[7]通過(guò)FRAP法對(duì)泰國(guó)的12種花卉進(jìn)行研究，測(cè)得萬(wàn)壽菊具有最高的三價(jià)鐵還原抗氧化能力。Sugawara等[8]發(fā)現(xiàn)菊類(lèi)中木犀草素-7-O-(6′-O-丙二酰胺)-葡萄糖苷具有很強(qiáng)的抗清除自由基的能力，其他的黃酮類(lèi)化合物如芹菜素、綠原酸、3，5-雙咖啡酰基奎寧酸等也具有很好的抗氧化活性。桂花也是一種常見(jiàn)的食用花卉，熊麗娜[9]18測(cè)得桂花黃酮總量為179.03 mg 蘆丁/g ·DW，桂花多酚的抗氧化能力為1 476.5 μmol TE/g ·DW，證明其有較強(qiáng)的抗氧化能力。木芙蓉、桅子和木槿等食用花卉亦具有清熱利濕、益胃生津、抗炎和涼血止血等功效[10-11]，但對(duì)它們抗氧化活性的綜合比較卻鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其具體多酚類(lèi)化合物組分的研究更是匱乏。因此，本研究通過(guò)3種體外抗氧化方法(ABTS、FRAP、DPPH)，對(duì)木槿、梔子、桂花、木芙蓉、黃色萬(wàn)壽菊和橙色萬(wàn)壽菊6種食用花卉的抗氧化活性能力進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)HPLC測(cè)定6種食用花卉的多酚類(lèi)化合物，比較各食用花卉的抗氧化能力差異性及其與物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)性。為食用花卉的開(kāi)發(fā)利用提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木槿(HibiscussyriacusLinn.)、梔子(GardeniajasminoidesEllis)、桂花[osmanthusfragrans(Thunb.) Lour.]、木芙蓉(HibiscusmutabilisL.)、黃色萬(wàn)壽菊[TageteserectaL. (Yellow)]、橙色萬(wàn)壽菊[TageteserectaL. (Orange) ]：2016年7～10月采摘于中南林業(yè)科技大學(xué)長(zhǎng)沙校區(qū)；

2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：分析純，都萊生物技術(shù)有限公司；

水溶性維生素E(Trolox)：分析純，華藍(lán)化學(xué)有限公司；

2，2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，合肥博美生物有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，日本TCI公司；

其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；

沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶素、阿魏酸、槲皮素、芹菜素、山奈酚：色譜純，成都曼思特生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜：LC-20A型，日本島津有限公司；

紫外可見(jiàn)光光度計(jì)：UV1800型，日本島津有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY 92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：JP-150A-8型，永康式久品工貿(mào)有限公司；

快速混勻儀：SK-E型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備 陰干花卉在40 ℃的烘箱內(nèi)干燥5 h，磨粉后過(guò)40目篩。稱(chēng)取2 g花粉，加入濃度為75%的乙醇30 mL，在40 ℃，80 W的條件下超聲波提取40 min。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮30 min待用。

1.3.2 多酚的測(cè)定 采用福林-酚試劑比色法[12]，多酚含量以每克樣品中沒(méi)食子酸毫克當(dāng)量表示(mg GAE/g· DW)。

1.3.3 黃酮的測(cè)定 采用亞硝酸鈉-氯化鋁法[13]，黃酮含量以每克樣品中兒茶素毫克當(dāng)量表示(mg CE/g· DW)。

1.3.4 花色苷的測(cè)定 參照Loizzo等[14]的pH示差法并略作修改，將1 mL提取物(1 g/15 mL 75%乙醇溶液)與49 mL 氯化鉀緩沖液(0.025 mol/L，pH 1)[或49 mL乙酸鈉緩沖液(0.025 mol/L，pH 4.5)]混合。10 min后，在510，700 nm測(cè)量每種溶液的原始吸光度。 吸光度差異計(jì)算如下：A=[(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5]。 使用矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷(ε=26 900 L/(mol·cm)，MW=449.2 g/mol)的摩爾吸光系數(shù)(ε)和分子量(MW)按式(1)計(jì)算花色苷含量。

(1)

式中：

C——花色苷含量，mg CyA/g· DW；

A——吸光度差異值；

MW——矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的分子量，g/mol；

DF——稀釋倍數(shù)；

l——光路長(zhǎng)，cm；

ε——矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，L/(mol·cm)；

1 000——轉(zhuǎn)換系數(shù)；

V——樣品提取液的體積，L；

m——樣品的重量，g。

1.3.5 類(lèi)胡蘿卜素的測(cè)定 采用比色法，參考文獻(xiàn)[15]修改如下：取樣品提取液加蒸餾水稀釋1～5倍后在440 nm處測(cè)定樣品的吸光度，同時(shí)用蒸餾水作空白對(duì)照。類(lèi)胡蘿卜素含量按式(2)計(jì)算:

(2)

式中：

C——類(lèi)胡蘿卜素含量，mg/ g· DW；

A——吸光度；

20——換算系數(shù)；

DF——稀釋因子；

V——提取液體積，L；

m——被測(cè)食用花卉的質(zhì)量，g。

1.3.6 DPPH抗氧化活性的測(cè)定 參考Gorjanovic等[16]的方法，抗氧化能力用每克樣品中Trolox微摩爾當(dāng)量表示(μmol TE/g ·DW)。

1.3.7 FRAP抗氧化活性的測(cè)定 參照Lu等[17]的方法，抗氧化能力用每克樣品中Trolox微摩爾當(dāng)量表示(μmol TE/g ·DW)。

1.3.8 ABTS抗氧化活性的測(cè)定 參照Oh等[18]的方法，抗氧化能力用每克樣品中Trolox微摩爾當(dāng)量表示(μmol TE/g ·DW)。

1.3.9 高效液相色譜法測(cè)定 參考Kaisoon等[7]、張倩倩等[19]的方法并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。使用島津LC-20A型高效液相系統(tǒng)，配備有二極管(PDA)陣列檢測(cè)器進(jìn)行梯度洗脫，樣品過(guò)0.45 μm膜。色譜柱：CNW Athena C18-WP(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相A為乙酸(pH 2.74)、流動(dòng)相B為乙腈，設(shè)定0.8 mL/min流速。梯度洗脫進(jìn)行：0～5 min，5%～9% B；5～12 min，9%～12% B；12～17 min，12%～18% B；17～21 min，18% B；21～28 min，18%～22% B；28～43 min，22%～70% B；43～55 min，70%～90% B；55～60 min，90%～5% B，最后用5% B再平衡5 min，柱溫度38 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣體積10 μL。各標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品過(guò)0.45 μm膜，采用外標(biāo)法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

各標(biāo)樣線(xiàn)性范圍、回歸方程、LOD、LOQ見(jiàn)表1。

2.2 6種食用花卉的抗氧化活性成分

通過(guò)HPLC對(duì)6種食用花卉中的具體活性成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1和表2，由表2可知，6種花卉抗氧化活性成分的種類(lèi)和含量有較大差異。如花色苷只在桅子花和芙蓉花檢測(cè)到；沒(méi)食子酸只在桅子花、桂花、黃色萬(wàn)壽菊、橙色萬(wàn)壽菊中檢測(cè)到；綠原酸、咖啡酸、芹菜素分別只在木槿花、桂花和木槿花中檢測(cè)到；阿魏酸除了芙蓉花，其他花卉中都能檢測(cè)到，6種食用花卉都檢測(cè)到的活性成分為類(lèi)胡蘿卜素、槲皮素和山奈酚。6種花卉中，多酚含量最多的為黃色萬(wàn)壽菊，其次為橙色萬(wàn)色壽菊，最少的為木槿花；黃酮含量最多的為黃色萬(wàn)壽菊，其次為桂花，最少的也為木槿花。黃帥等[20]研究表明萬(wàn)壽菊中存在類(lèi)胡蘿卜素、沒(méi)食子酸、槲皮素等成分，本研究結(jié)果除這些成分外，還從中檢測(cè)到了阿魏酸和山奈酚等活性成分。苗苗等[21]測(cè)得萬(wàn)壽菊黃酮含量為121.4 mg/g· DW，均低于本試驗(yàn)測(cè)得的2種萬(wàn)壽菊總黃酮含量。本試驗(yàn)測(cè)得的桂花總黃酮含量與2種萬(wàn)壽菊較接近，為(176.16±1.24) mg RT/g·DW，與熊麗娜[9]18測(cè)得桂花黃酮總量(179.03 mg/g·DW)結(jié)果相近。尹偉等[22]研究表明桂花中含有綠原酸、咖啡酸、山奈酚、槲皮素等化合物，本試驗(yàn)中未檢出綠原酸，但檢出了咖啡酸、山奈酚、槲皮素、阿魏酸和沒(méi)食子酸。宋家玲等[23]利用各種波普技術(shù)鑒定出梔子花中存在山奈酚、槲皮素、β-胡蘿卜苷等15種化合物，同樣在本試驗(yàn)中，從桅子花中也檢測(cè)到了山奈酚、槲皮素，此外還有阿魏酸和沒(méi)食子酸；李軍茂等[24]利用超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS) 技術(shù)鑒定木芙蓉中包含蘆丁、山奈酚、槲皮素等化合物，蔣益花等[25]利用微波技術(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)得木芙蓉中黃酮含量為31.78 mg/g ·DW，與本試驗(yàn)接近。 衛(wèi)強(qiáng)等[26]在木槿的乙醇提取物中鑒定出β-胡蘿卜苷、山奈酚、芹菜素等化合物，張文彥等[27]測(cè)得木槿花中總黃酮含量為6.01 mg/g·DW，低于本試驗(yàn)的12.52 mg/g·DW。6種花卉中抗氧化活性成分總量的排名為：橙色萬(wàn)壽菊>黃色萬(wàn)壽菊>梔子花>桂花>芙蓉花>木槿花。6種常見(jiàn)花卉中所含多酚、黃酮及其他活性成分與已有研究存在一定差異，可能與花卉活性成分的提取方法、試驗(yàn)條件及花卉的地區(qū)不同有一定關(guān)系。

表1 8種酚類(lèi)化合物回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性檢測(cè)范圍Table 1 Linear regression equation, correlation coefficient and linearity of eight reference standards

表2 6種食用花卉抗氧化活性成分?Table 2 Antioxidant active ingredient of six kinds of edible flowers

? 同一列不同小寫(xiě)字母表示數(shù)值間差異顯著(P<0.05)；nd表示該物質(zhì)在樣品中未檢測(cè)到或濃度低于檢測(cè)限，*總量為除多酚和黃酮之外的其他成分之和。

1. 沒(méi)食子酸 2. 綠原酸 3. 咖啡酸 4. 兒茶素 5. 阿魏酸 6. 槲皮素 7. 芹菜素 8. 山奈酚

圖1 乙醇提取食用花卉樣品高效液相色譜圖

Figure 1 HPLC
Figure of edible flowers samples extract with ethonal

結(jié)合相關(guān)研究，苗苗等[20]測(cè)的梔子花總黃酮含量為13.3 mg/g ·DW，萬(wàn)壽菊黃酮含量為121.4 mg/g· DW，本試驗(yàn)測(cè)得的總黃酮含量均高于已有研究。熊麗娜[9]18測(cè)得桂花黃酮總量為179.03 mg/g· DW，與本試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果相近。黃帥等[21]研究表明萬(wàn)壽菊中存在類(lèi)胡蘿卜素、沒(méi)食子酸、槲皮素等成分；宋家玲等[22]利用各種波普技術(shù)鑒定出梔子花中存在山奈酚、槲皮素、β-胡蘿卜苷等15種化合物；李軍茂等[23]利用超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS) 技術(shù)鑒定木芙蓉中包含蘆丁、山奈酚、槲皮素等化合物；蔣益花等[24]利用微波技術(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)得木芙蓉中黃酮含量為31.78 mg/g ·DW；尹偉等[25]發(fā)現(xiàn)桂花中含有綠原酸、咖啡酸、山奈酚、槲皮素等化合物；衛(wèi)強(qiáng)等[26]在木槿的乙醇提取物中鑒定出β-胡蘿卜苷、山奈酚、芹菜素等化合物，張文彥等[27]測(cè)得木槿花中總黃酮含量為6.01 mg/g· DW，低于本試驗(yàn)的12.52 mg/g ·DW。在鑒定這6種常見(jiàn)花卉中所含多酚、黃酮的具體成分方面，本試驗(yàn)結(jié)果與已有研究存在一定差異，可能與花卉活性成分的提取方法、試驗(yàn)條件及花卉的地區(qū)不同有一定關(guān)系。

2.3 6種食用花卉的抗氧化能力比較

由圖2可知，不同品種花卉中的抗氧化活性具有顯著性差異(P<0.05)。ABTS自由基的清除能力介于100.12～1 708.03 μmol TE/g· DW，其抗氧化活性排序?yàn)椋狐S色萬(wàn)壽菊>橙色萬(wàn)壽菊>桂花>芙蓉花>木槿花>梔子花，黃色萬(wàn)壽菊ABTS活性值的含量約是梔子花的18倍。FRAP抗氧化活性值介于100.20～2 621.25 μmol TE/g· DW，花卉的含量排名與ABTS基本一致，略有不同之處在于梔子花的FRAP抗氧化值略高于木槿花，但二者含量也基本相當(dāng)，黃色萬(wàn)壽菊的FRAP抗氧化值也遠(yuǎn)高于排名第二的橙色萬(wàn)壽菊。DPPH自由基清除能力介于45.13～1 092.49 μmol TE/g·DW，其抗氧化活性按照高低次序排列為：橙色萬(wàn)壽菊>黃色萬(wàn)壽菊>桂花>芙蓉花>梔子花>木槿花，本試驗(yàn)測(cè)定橙色萬(wàn)壽菊的DPPH自由基清除能力約是木槿的22倍，金月亭等[28]測(cè)得木槿花DPPH自由基清除能力為51.8 μmol TE/g· DW，與本試驗(yàn)結(jié)果比較接近。

同一圖例上不同小寫(xiě)字母代表抗氧化活性差異顯著(P<0.05) 圖2 6種食用花卉抗氧化活性Figure 2 Antioxidant activity of 6 kinds of edible flowers

熊麗娜[9]30測(cè)得桂花ABTS抗氧化活性值為426.6 μmol TE/g· DW，DPPH抗氧化活性值為546.1 μmol TE/g ·DW，F(xiàn)RAP抗氧化活性值為1 556.1 μmol TE/g· DW，其中ABTS 與DPPH的抗氧化活性值與本試驗(yàn)所得結(jié)果相近，而FRAP抗氧化活性值與本試驗(yàn)結(jié)果有較大差距。綜合3種抗氧化測(cè)定方法結(jié)果，抗氧化活性最強(qiáng)的是黃色萬(wàn)壽菊，其次是橙色萬(wàn)壽菊、桂花、芙蓉花、木槿花和梔子花。這一結(jié)論與各花卉抗氧化活性成分含量，尤其是多酚含量排名基本一致，證實(shí)了唐津忠[29]的觀(guān)點(diǎn)，即抗氧化能力與抗氧化成分含量呈正比。食用花卉中各活性成分差異較大，因此，有必要對(duì)食用花卉的具體成分進(jìn)一步分離純化，并比較主要單體活性成分的抗氧化活性及其對(duì)抗氧化作用的貢獻(xiàn)、協(xié)同抗氧化機(jī)理，以推動(dòng)了食用花卉的開(kāi)發(fā)與綜合利用。

2.4 抗氧化活性成分與抗氧化活性相關(guān)性分析

對(duì)食用花卉的抗氧化活性成分含量與抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，由于所有變量在5%的顯著水平上均不符合正態(tài)分布，故采用Spearman相關(guān)性分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。DPPH的清除活力與TPC(r=0.943)含量之間有較強(qiáng)的相關(guān)性、與TFC(r=0.829)含量之間有較弱的相關(guān)性。FRAP與TPC(r=1)、TFC(r=0.943)含量間有顯著的相關(guān)性。ABTS與TPC(r=0.943)含量之間有強(qiáng)相關(guān)性、與TFC(r=0.886)含量間有較弱的相關(guān)性，證實(shí)了太志剛[30]的觀(guān)點(diǎn)，即通過(guò)ABTS法發(fā)現(xiàn)白刺花提取物清除ABTS+自由基的能力隨含量的增加而增強(qiáng)。同時(shí)3種抗氧化活性(DPPH、ABTS、FRAP)之間的相關(guān)性表現(xiàn)出顯著性水平，相關(guān)系數(shù)在P<0.01水平上至少達(dá)到0.886，表明抗氧化活性測(cè)定都是可靠和可互換的。李華等[31]測(cè)得DPPH與ABTS、DPPH與FRAP、ABTS與FRAP的相關(guān)性均達(dá)0.999 8。本試驗(yàn)測(cè)得DPPH與FRAP相關(guān)性r=0.943(P<0.01)、FRAP與ABTS相關(guān)性r=0.943(P<0.01)，DPPH與ABTS相關(guān)性r=0.886(P<0.01)，都有較顯著的相關(guān)性。

表3食用花卉的抗氧化活性成分與抗氧化活性斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)?

Table 3 Spearman correlation coefficients between the antioxidant activity and the antioxidant contents of edible flowers

相關(guān)系數(shù)DPPHFRAPABTSTPCTFCDPPH1.0000.943**0.886*0.943**0.829*FRAP1.0000.943**1.000**0.943**ABTS1.0000.943**0.886*TPC1.0000.943**TFC1.000

? **代表在置信度(雙側(cè))為0.01時(shí)，相關(guān)性是顯著的。

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了木槿花、梔子花、芙蓉花、桂花、黃色萬(wàn)壽菊和橙色萬(wàn)壽菊的主要抗氧化活性成分及其抗氧化的能力。通過(guò)高效液相色譜分離技術(shù)，得出6種食用花卉共有的活性成分含量的總體趨勢(shì)是：黃酮>多酚>山奈酚>槲皮素>類(lèi)胡蘿卜素。通過(guò)對(duì)6種食用花卉的11種活性成分的總量比較，抗氧化活性成分含量最高的為黃色萬(wàn)壽菊，其余的高低排列順序?yàn)槌壬f(wàn)壽菊、桂花、梔子花、芙蓉花和木槿花。通過(guò)Spearman相關(guān)性分析表明，食用花卉的抗氧化活性成分含量與抗氧化能力有顯著相關(guān)性。多酚和黃酮的含量與DPPH、FRAP和ABTS間存在顯著的相關(guān)性，但黃酮的含量與DPPH的抗氧化能力間的相關(guān)性未達(dá)到極顯著水平，這對(duì)抗氧化活性物質(zhì)的針對(duì)性利用提供了理論依據(jù)。綜合3種抗氧化活性測(cè)定方法(DPPH、FRAP和ABTS)，得出每種抗氧化活性測(cè)定方法中抗氧化活性最強(qiáng)的花卉品種不同?？寡趸钚宰顝?qiáng)的是黃色萬(wàn)壽菊，其次是橙色萬(wàn)壽菊、桂花、芙蓉花、木槿花和梔子花。本研究對(duì)于食用花卉的綜合利用具有一定的指導(dǎo)意義，但對(duì)花卉抗氧化各組分抗氧化及協(xié)同作用和抗氧化機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。