王 丹，任 玫，吳 飛，常建軍，李璐瑤，康 明，林 青*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；3.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016；4.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的機(jī)會(huì)性人獸共患腸道原蟲，宿主范圍廣泛，可引起宿主腹瀉和呼吸道癥狀，對(duì)兒童和免疫缺陷的宿主造成嚴(yán)重腹瀉甚至死亡。目前已報(bào)道的隱孢子蟲有效種有33種[1-2]。在我國(guó)，人、牛、豬、羊、禽類等均被報(bào)道有不同程度的隱孢子蟲感染[3-7]。隱孢子蟲的檢測(cè)方法有多種，傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于樣品和檢測(cè)人員技術(shù)要求較高[8-9]。而目前常用的分子生物學(xué)診斷法中的PCR檢測(cè)方法過(guò)程繁瑣復(fù)雜，對(duì)儀器設(shè)備要求較高，不利于在艱苦偏遠(yuǎn)地區(qū)推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法的建立，提供了一種操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)[10]，被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)DNA和RNA的檢測(cè)[11]。

有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，青海省牦牛隱孢子蟲的感染率為10.4%～39.7%[12-14]，隱孢子蟲感染對(duì)當(dāng)?shù)仃笈５酿B(yǎng)殖產(chǎn)生非常不利的影響，且可能會(huì)帶來(lái)人獸共患病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。為了更好地防控牦牛隱孢子蟲病的發(fā)生和傳播，早期快速而準(zhǔn)確地診斷就顯得非常重要?；诖耍瑪M建立一種快速而靈敏的牦牛隱孢子蟲檢測(cè)方法并將其推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品 試驗(yàn)用的糞便樣品均由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，樣品采自青海省放牧飼養(yǎng)的牦牛，在25 g/L重鉻酸鉀溶液中4℃下保存。

1.1.2 蟲種 隱孢子蟲(Cryptosporidium)、藍(lán)氏賈第蟲(Giardialamblia)、阿米巴原蟲(Entamoeba)、芽囊原蟲(Blastocystis)4種寄生蟲樣品,均由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 Bst 大片段DNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase Large Fragmnet)、10×Themopol Reaction Buffer,New England Biolab公司產(chǎn)品；10000×SYBR GreenⅠ,Solarbio公司產(chǎn)品；MgCl2、dNTP Mixture,TaKaRa公司產(chǎn)品；糞便DNA提取試劑盒,OMEGA公司產(chǎn)品；高速離心機(jī),購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋,購(gòu)自國(guó)華電器有限公司；PCR擴(kuò)增儀,購(gòu)自杭州博日科技有限公司；DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,購(gòu)自北京六一廠。

1.2 方法

1.2.1 糞便基因組DNA提取 每份樣品取0.5 mL 于1.5 mL EP管中，加入蒸餾水洗滌5次，以洗去重鉻酸鉀溶液。然后根據(jù)EZNA?Stool DNA Kit 提供的步驟提取樣品基因組DNA。獲得的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)和合成 本試驗(yàn)對(duì)牦牛源的C.parvum、C.bovis、C.ryanae(GenBank登錄號(hào)分別為KY809008、KF128742、KY809007)的18 S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)6條LAMP引物，引物由北京藍(lán)譜生物科技有限公司設(shè)計(jì)，引物序列見表1。套式PCR擴(kuò)增引物參照Xiao L等[15]設(shè)計(jì)的基于隱孢子蟲18 S rRNA基因的2對(duì)引物，其序列見表2。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 隱孢子蟲18 S rRNA 基因的LAMP引物

表2 隱孢子蟲18 S rRNA基因的套式PCR引物

1.2.3 LAMP方法的優(yōu)化及建立 參考NEW ENGLAND BioLabs擴(kuò)增反應(yīng)體系，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)調(diào)整外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物的比例，確定反應(yīng)最佳引物濃度。調(diào)整buffer、MgCl2、dNTP Mixture及酶的濃度，并對(duì)反應(yīng)過(guò)程、時(shí)間、溫度進(jìn)行優(yōu)化，反復(fù)試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 分別選用隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲、阿米巴原蟲、芽囊原蟲等原蟲的基因組DNA作為模板，利用建立的LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并用雙蒸水作為空白對(duì)照。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，若電泳圖呈現(xiàn)特征性梯狀條帶則判定該反應(yīng)為陽(yáng)性。每管產(chǎn)物加1 μL 1 000×SYBR Green Ⅰ，呈現(xiàn)綠色判定為陽(yáng)性，保持棕色不變判定為陰性。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 將隱孢子蟲陽(yáng)性樣本總DNA倍比稀釋，測(cè)定樣本DNA的濃度為26 ng/μL。以稀釋樣本作為模板，分別用建立的LAMP方法和套式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 以相同的隱孢子蟲陽(yáng)性DNA為模板，用建立的LAMP方法進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證批內(nèi)重復(fù)性。同時(shí)對(duì)6份隱孢子蟲陽(yáng)性樣本進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)3次，以驗(yàn)證批間重復(fù)性。

1.2.7 樣品檢測(cè) 用所建立的LAMP方法對(duì)在青海省某地區(qū)采集的60份牦牛糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用套式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系的確定

通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，隱孢子蟲LAMP反應(yīng)體系為25 μL：F3、B3引物(10 mmol/L)各0.25 μL，F(xiàn)IP、FBP引物(10 mmol/L)各2 μL，LP、LB引物(10 mmol/L)各1 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.5 μL,Bst DNA 聚合酶(8 U/μL)1 μL，10× Themopol reaction buffer 1.5 μL，DNA模板2 μL，超純水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)體系終濃度見表3。擴(kuò)增條件：反應(yīng)混合物先在95℃水浴加熱5 min，置于冰上冷卻5 min，加Bst 大片段DNA 聚合酶，然后65℃孵育60 min，最后80℃加熱10 min終止反應(yīng)(表3)。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的LAMP方法對(duì)隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲、阿米巴原蟲、芽囊原蟲等陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有隱孢子蟲陽(yáng)性樣品中能擴(kuò)增出LAMP產(chǎn)物特有的梯狀條帶(圖1)，產(chǎn)物加入1 μL 1 000×SYBR Green Ⅰ后，也只有隱孢子蟲LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色(圖2)。

表3 LAMP反應(yīng)體系

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.隱孢子蟲；2.藍(lán)氏賈第蟲；3.阿米巴原蟲；4.芽囊原蟲；5.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Cryptosporidium；2.G.lamblia；3.E.histolytica；4.Blastocystis； 5.Negative control

圖1 LAMP方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.1 The specificity test result of LAMP

1.隱孢子蟲；2.藍(lán)氏賈第蟲；3.阿米巴原蟲；4.芽囊原蟲；5.陰性對(duì)照

1.Cryptosporidium；2.G.lamblia；3.E.histolytica；4.Blastocystis； 5.Negative control

圖2 LAMP方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.2 The specificity test result of LAMP

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

LAMP方法和套式PCR方法檢測(cè)結(jié)果分別如圖3和圖4所示，LAMP方法能夠檢測(cè)出16倍稀釋的樣本DNA，而PCR方法只能檢測(cè)2倍稀釋的樣本DNA，試驗(yàn)表明LAMP的靈敏度是套式PCR方法的8倍。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～8.倍比稀釋的DNA

M.DNA Marker DL 2 000；1.Positive control；2-8.Doubling dilution DNA

圖3隱孢子蟲的LAMP檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 The results of LAMP forCryptosporidium

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～8.倍比稀釋的DNA

M.DNA Marker DL 2 000；1.Positive control；2-8.Doubling dilution DNA

圖4隱孢子蟲的套式PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 The results of nested PCR forCryptosporidium

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)建立的LAMP方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，如圖5和圖6所示。

1～6.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；7.陰性對(duì)照

1-6.Products of LAMP；7.Negative control

圖5批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.5 The repeatability result of inter-assay

1～6,8～13,15～20.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；7,14,21.陰性對(duì)照

1-6,8-13,15-20.Products of LAMP；7,14,21.Negative control

圖6批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.6 The repeatability result of intra-assay

2.5 樣品檢測(cè)

對(duì)60份采自青海的牦牛糞便樣品分別用LAMP方法和套式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法均檢測(cè)出一一對(duì)應(yīng)的11份陽(yáng)性樣品，符合率為100%。

3 討論

目前，隱孢子蟲的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)法主要利用改良抗酸染色法、熒光染色法等進(jìn)行卵囊檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大量樣本的檢測(cè)。常用的免疫學(xué)方法有免疫熒光法、隱孢子蟲抗體間接ELISA法，特異性和靈敏度較分子生物學(xué)方法稍差[16]。常用的分子生物學(xué)診斷方法有普通PCR、套式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和LAMP檢測(cè)方法，這些方法檢測(cè)靈敏，結(jié)果可靠，并適合用于大量樣本檢測(cè)。其中LAMP方法比PCR方法更加簡(jiǎn)便、靈敏，不需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜溫度變化過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)只需1.5 h，反應(yīng)結(jié)果可以電泳檢測(cè)，也可通過(guò)染料顯色直接判定，更加適合在實(shí)驗(yàn)條件較差的偏遠(yuǎn)地區(qū)推廣使用。

本試驗(yàn)根據(jù)LAMP的原理，針對(duì)隱孢子蟲18 S rRNA基因，設(shè)計(jì)6條引物，優(yōu)化并建立LAMP方法。選用陽(yáng)性隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲、阿米巴原蟲和芽囊原蟲作為對(duì)照，同時(shí)以雙蒸水作為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)該組引物的特異性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳只有陽(yáng)性隱孢子蟲出現(xiàn)梯狀條帶，且染料顯色呈陽(yáng)性，其他幾個(gè)原蟲和陰性對(duì)照組均無(wú)條帶出現(xiàn)，且染料顯色均呈陰性。表明該組引物特異性良好。敏感性試驗(yàn)顯示LAMP方法比套式PCR方法靈敏度高8倍。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明該方法重復(fù)性良好。同時(shí)對(duì)LAMP方法和套式PCR方法的檢出率進(jìn)行比較，從數(shù)據(jù)來(lái)看，所建立的LAMP方法檢測(cè)陽(yáng)性率結(jié)果和套式PCR檢測(cè)結(jié)果是一致的。本試驗(yàn)所建立的LAMP方法具有較好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，可以作為一種快速、簡(jiǎn)單且靈敏的檢測(cè)方法對(duì)牦牛源隱孢子蟲進(jìn)行檢測(cè)。

LAMP方法也存在著一定的缺陷，比如其產(chǎn)物復(fù)雜，不能測(cè)序鑒定，也不能進(jìn)行分型，只適用病原檢測(cè)。而且LAMP反應(yīng)敏感性高，因此較易出現(xiàn)氣溶膠污染[17]，可以加入可見光染料代替熒光染料進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于避免開蓋污染引起的假陽(yáng)性有一定的效果[18]。繼續(xù)探索和完善該技術(shù)，以便在臨床廣泛應(yīng)用，對(duì)于及時(shí)監(jiān)控和預(yù)防疫病的傳播具有重要作用。

本試驗(yàn)建立的LAMP方法為牦牛隱孢子蟲感染的檢測(cè)提供了有效的方法，對(duì)于青海等偏遠(yuǎn)地區(qū)牦牛隱孢子蟲病的防控具有重要意義。