欒 璐，刁小龍，劉云迎，張家銘，王 飛，何海蓉

（中崇信諾生物科技泰州有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品畜禽投入品安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又名豬地方性流行性肺炎（Enzootic pneumoniae of swine，EPS）或者豬喘氣病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引發(fā)的一種接觸性和慢性呼吸道傳染病[1]，該病的最主要傳染源是帶菌豬和患病豬，其傳播途徑為直接接觸和空氣傳播[2]，當(dāng)患病豬和健康豬混合飼養(yǎng)時(shí)，常會(huì)引發(fā)大規(guī)模傳播，Mhp 也可以和其它病原體一起混合感染，導(dǎo)致各個(gè)年齡段、種類(lèi)的豬均能感染發(fā)病，其臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、發(fā)育遲緩、料肉比低。該病發(fā)病率高，死亡率低，世界各地均有流行[3]，是造成養(yǎng)豬行業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。

Mhp 無(wú)細(xì)胞壁，經(jīng)電鏡觀(guān)察可見(jiàn)球狀、環(huán)狀、絲狀及點(diǎn)狀等菌體形態(tài)[4]。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d～14 d，形成半透明、圓形，邊緣不整齊，且少數(shù)有中間頂端突起，大小100 μm～300 μm 的菌落。當(dāng)前檢測(cè)Mhp 方法主要有分離培養(yǎng)法、免疫熒光法、核酸探針?lè)?、PCR 等等[5]，這些方法雖然可檢測(cè)出病原，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、特異性和敏感性不高、錯(cuò)配率較高等缺點(diǎn)[6]。而套式PCR 的優(yōu)點(diǎn)是增加擴(kuò)增倍數(shù)，提高了敏感性；由于第二輪PCR 模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的可能性，從而保證了擴(kuò)增的特異性[7]。

對(duì)Mhp 的檢測(cè)靶基因有P36、P46、P97、P110等，其中P36 基因編碼乳酸脫氫酶蛋白（LDH），LDH是Mhp 的特異性免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，極具保守和特異性，其在各個(gè)血清型Mhp 之間的同源性很高，能夠誘導(dǎo)早期免疫反應(yīng)[8-10]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank 中Mhp P36基因序列，利用Clustal 多重序列比對(duì)軟件（Clust?al Multiple Alignment Algorithm）比對(duì)Mhp P36 基因序列，選擇其保守區(qū)域，設(shè)計(jì)內(nèi)外套引物，建立Mhp套式PCR 檢測(cè)方法，為Mhp 的流行病學(xué)調(diào)查提供檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株和臨床樣品Mhp 168 株菌種由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。雞毒支原體（MG）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬鼻支原體（BRP）、豬鏈球菌（SS）、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌（APP）、副豬嗜血桿菌（HPS）的全基因組DNA 均由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供。50 份含Mhp 的待測(cè)液體培養(yǎng)基來(lái)自江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心。

1.2 主要試劑DNA 提取試劑盒、Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；電泳緩沖液（50×TAE Buf?fer）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Mhp核酸檢測(cè)試劑盒（PCR 法）購(gòu)自廣州維伯鑫生物科技股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中Mhp P36基因序列（X67286.1、AY312243.1、MG813457.1、MG813451.1、MG813441.1、GU644440.1），利用Clustal 多重序列比對(duì)軟件（Clustal Multiple Alignment Algorithm）選擇其保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。同時(shí)，利用Clustal多重序列比對(duì)軟件Alignment 對(duì)Mhp 168 株P(guān)36 基因序列與GenBank 登錄的8 個(gè)Mhp 標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)36 基因序列（AY312243.1、 GU644440.1、 X67286.1、 AE017332.1、NC_007332.1、AE017243.1、CP003131.1、NC_021831.1）進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primers for the nested PCR

1.4 套式PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化提取Mhp 168 株的基因組DNA，以此為模板，利用表1 的引物進(jìn)行套式PCR 擴(kuò)增。外套PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：DNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL（濃度在5 pmol/μL～20 pmol/μL 優(yōu)化）、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL、MgCl2（25 mmol/L）3 μL、10 × PCR Buffer 2.5 μL、無(wú)核酸酶水8.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min，95 ℃30 s，退火溫度以1 ℃遞增共設(shè)置8 個(gè)溫度（59.0 ℃～66.0 ℃）30 s，72 ℃1 min，共34 個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min。將外套擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物10 倍稀釋后，作為內(nèi)套PCR 擴(kuò)增的模板，利用內(nèi)套引物P3/P4 在相同反應(yīng)體系與條件下進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，退火溫度設(shè)置8 個(gè)溫度（47.0 ℃～54.0 ℃），引物濃度（5 pmol/μL～20 pmol/μL）進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以Mhp 168 株的基因組為模板，采用最佳的退火溫度和引物濃度進(jìn)行該套式PCR 擴(kuò)增，并將得到的內(nèi)套PCR產(chǎn)物由上海華大基因科技有限公司測(cè)序，采用BLAST 對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.5 特異性試驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)建立的套式PCR 方法對(duì)MG、BRP、SS、APP、HPS、PCV2、PRV 的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以Mhp 168 株基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)酶水為陰性對(duì)照，評(píng)估該套式PCR方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)利用核酸蛋白分析儀對(duì)Mhp 168株基因組DNA 樣本的原始核酸濃度進(jìn)行測(cè)定，按照公式：拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×阿伏伽德羅常數(shù)/（1 個(gè)堿基對(duì)的平均分子質(zhì)量×質(zhì)?？傞L(zhǎng)度），計(jì)算其拷貝數(shù)后，10 倍倍比稀釋?zhuān)?～106），采用本研究建立的套式PCR 方法和常規(guī)PCR 方法（Mhp 核酸檢測(cè)試劑盒）分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，評(píng)估該套式PCR 方法的敏感性。

1.7 臨床樣品的檢測(cè)50 份含Mhp 的液體培養(yǎng)基分別取2 mL，12 000 r/min 離心20 min，棄去上清，采用DNA 提取試劑盒提取其全基因組DNA，利用本研究建立的套式PCR、常規(guī)PCR、Mhp 分離培養(yǎng)方法[11]同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以Mhp 168 株基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照，水作為陰性對(duì)照，比較3 種方法的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算相應(yīng)的符合率，評(píng)價(jià)該套式PCR 方法的臨床應(yīng)用性。

2 結(jié) 果

2.1 Mhp 的P36 基因序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析將Mhp 168 株P(guān)36 基因序列與GenBank 登錄的8 個(gè)不同血清型的Mhp 標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)36 基因序列進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果顯示，Mhp 168株 與8 個(gè)Mhp 株P(guān)36 基 因 序 列 同 源 性 高 達(dá)99.09%～100%，P36 基因編碼的氨基酸序列同源性為99.14%～100%。上述結(jié)果表明，不同血清型Mhp 的P36 基因序列同源性極高，因此，本研究利用Mhp168 株P(guān)36基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)內(nèi)外套引物，作為檢測(cè)不同血清型Mhp的通用引物，建立套式PCR 方法。

2.2 套式PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果以Mhp 168 株DNA 為模板，分別對(duì)外套PCR 擴(kuò)增的退火溫度和上下游引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，上下游引物濃度均為10 pmol/μL 時(shí)擴(kuò)增效果最佳（圖略）；各個(gè)退火溫度均能擴(kuò)增出目的條帶，且在63 ℃時(shí)目的條帶最為清晰明亮，且無(wú)非特異性擴(kuò)增（圖1A），再將退火溫度63 ℃的外套PCR 產(chǎn)物10 倍稀釋?zhuān)鳛閮?nèi)套PCR 擴(kuò)增的模板，進(jìn)行內(nèi)套PCR 退火溫度和引物濃度的優(yōu)化。結(jié)果顯示，上下游引物濃度為10 pmol/μL時(shí)擴(kuò)增效果最佳（圖略）；各個(gè)退火溫度均能擴(kuò)增出目的條帶，且在50 ℃時(shí)目的條帶最為清晰明亮，且無(wú)非特異性擴(kuò)增（圖1B），所以確定63 ℃和50 ℃分別為該Mhp 套式PCR 方法的外套和內(nèi)套PCR 擴(kuò)增的最佳退火溫度，10 μmol/L 為該Mhp 套式PCR 方法的最佳引物濃度。

圖1 套式PCR 外套PCR 擴(kuò)增（A）與內(nèi)套PCR 擴(kuò)增（B）的退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimized annealing temperature for the nested PCR external(A)and internal(B)amplification

2.3 套式PCR 產(chǎn)物的測(cè)序鑒定以Mhp 168 株DNA 為模板，利用建立的套式PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出外套793 bp 和內(nèi)套448 bp 的目的條帶，將內(nèi)套PCR 產(chǎn)物測(cè)序序列經(jīng)NCBI BLAST 比對(duì)分析顯示，擴(kuò)增的448 bp Mhp 目的片段與GenBank 中Mhp P36 基因（AY312243.1）的相應(yīng)片段相似性高達(dá)99.89%，表明該套式PCR 適用于對(duì)Mhp 的檢測(cè)。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用該套式PCR 方法，分別 對(duì)MG、 BRP、 SS、 APP、 HPS、 PCV2、 PRV、Mhp 168 株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，僅Mhp 擴(kuò)增出外套793 bp 和內(nèi)套448 bp 的目的條帶，其余病原擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖2），表明建立的該套式PCR方法特異性較強(qiáng)。

圖2 套式PCR 特異性的試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The result of specificity test

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果利用核酸蛋白分析儀測(cè)得Mhp 168 株的核酸濃度為20 ng/μL，經(jīng)計(jì)算得出其核酸濃度為1×106拷貝/μL。將其10 倍倍比稀釋后，利用套式PCR 方法和常規(guī)PCR 方法分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該套式PCR 和常規(guī)PCR 的檢測(cè)下限分別為10 拷貝/μL 和103拷貝/μL（圖3），套式PCR的敏感性是常規(guī)PCR 方法的100 倍，表明本研究建立的Mhp 套式PCR 方法敏感性較高。

2.6 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果提取50 份含Mhp 的培養(yǎng)基的全基因組DNA，利用該套式PCR、常規(guī)PCR、Mhp 分離培養(yǎng)方法分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，這3種方法對(duì)Mhp 的檢出率分別為88%（44/50）、82%（41/50）、88%（44/50）。套式PCR 與常規(guī)PCR 陽(yáng)性符合率為93.2%，陰性符合率為66.7%，總體符合率為94%；套式PCR 方法與Mhp 分離培養(yǎng)方法的符合率為100%（表2）。表明套式PCR 方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率較高，可以用于臨床樣品的檢測(cè)。

圖3 套式PCR（A）與常規(guī)PCR（B）的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensibility test of the nested PCR(A)and conventional PCR(B)

表2 3 種不同的方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection of clinical samples by three different methods

3 討 論

近年來(lái)，由Mhp 與細(xì)菌、病毒等病原協(xié)同作用而引起的豬病嚴(yán)重影響到豬業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和效益，阻礙我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的擴(kuò)大和發(fā)展[12]，因此，急需開(kāi)發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)Mhp。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，有研究人員已于2014 年建立了基于Mhp P46 基因的常規(guī)PCR 方法，其對(duì)Mhp的檢測(cè)下限為0.675 μg/μL[13]。徐引弟等于2019 年建立了基于16S rRNA 基因的常規(guī)PCR 方法，其對(duì)Mhp的檢測(cè)下限為0.1 μg/μL[14]，而吉瑪?shù)热薣5]和張旭等人[15]建立的基于P36 基因的套式PCR 方法，其對(duì)Mhp 的檢測(cè)下限分別為0.1 pg/μL 和3.3 pg/μL，表明套式PCR 的敏感性明顯高于常規(guī)PCR。套式PCR 具有敏感性高、費(fèi)用相對(duì)便宜，不需要特殊儀器設(shè)備等優(yōu)勢(shì)[16-18]，能夠廣泛應(yīng)用于臨床病原的檢測(cè)。

Mhp 中有一些重要的免疫原性蛋白，包含3 個(gè)膜蛋白P46、P65、P74 以及黏附素P97，細(xì)胞溶脂蛋白P36 等[19]，但有研究表明基于Mhp P36 基因設(shè)計(jì)的引物建立的套式PCR 方法的敏感性明顯高于其它基因引物[20]。所以本研究首先分析了Mhp 168 株的P36 基因序列與8 個(gè)不同血清型的Mhp 標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)36 基因序列的同源性。結(jié)果顯示，Mhp 168 株P(guān)36 基因序列與GenBank 中8 個(gè)Mhp 標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)36 基因序列及其編碼的氨基酸序列同源性均很高。所以本研究選用Mhp 168 株的P36 基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)出內(nèi)外套引物，通過(guò)條件優(yōu)化建立了檢測(cè)Mhp 的套式PCR方法。

由于套式PCR 要進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增，引起交叉污染的幾率較大，在檢測(cè)Mhp 時(shí)極易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。為了克服此缺點(diǎn)，本研究將外套PCR 產(chǎn)物10倍倍比稀釋后，作為內(nèi)套PCR 擴(kuò)增的模板，來(lái)降低DNA 模板量，且在生物安全柜中配置PCR 反應(yīng)體系，避免了檢測(cè)Mhp 時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，同時(shí)內(nèi)外套引物退火溫度不同，也可以減少交叉污染的幾率。從而提高其特異性。本研究建立的套式PCR 方法，對(duì)Mhp 的最低檢測(cè)限為10 拷貝/μL，且特異性較強(qiáng)。通過(guò)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，套式PCR 方法與常規(guī)PCR 的總體符合率為94%，與Mhp 分離培養(yǎng)方法的符合率為100%。表明該套式PCR 方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率較高，可以用于臨床樣品的檢測(cè)，為Mhp 的流行病學(xué)調(diào)查提供了檢測(cè)手段。