張 行，楊 峰，嚴(yán) 勇，李新圃，王旭榮，羅金印，李宏勝

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州730050）

葡萄球菌分為凝固酶陽性（Coagulase-positive staphylococci，CPS）和凝固酶陰性（Coagulase-negative staphylococci，CNS）兩大類，到目前為止，葡萄球菌屬包括49 種、26 個亞種葡萄球菌[1-2]。長期以來，人們對葡萄球菌致病性的研究主要集中在CPS 上，而對CNS 的關(guān)注和研究較少。然而，隨著CNS 在臨床中檢出率的不斷升高，人們開始重視這一類病原菌的深入研究。

CNS 是一種人畜共患條件致病菌之一，能引起人和動物的多種感染[3]。對人類的致病性主要引起心內(nèi)膜炎、敗血癥和血液感染等疾病；對動物的致病性主要引起奶牛的乳腺炎，尤其在牛隱性乳房炎中，CNS 已成為包括我國在內(nèi)的國家或地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原菌[4-6]。人或動物一旦感染CNS，將會很難徹底治愈，因?yàn)镃NS 通常會在物體或組織表面產(chǎn)生生物被膜（Biofilm，BF），進(jìn)而對多種抗生素表現(xiàn)耐藥[7]。BF 的產(chǎn)生可使CNS 對抗生素的耐藥性增加1 000 倍[8]。此外，CNS 還能產(chǎn)生各種致病因子，如脂肪酶，脫氧核糖核酸酶和腸毒素等，對人和動物造成損害[9]。為了更好的治療和控制CNS 相關(guān)疾病，本文從CNS 常見的檢測鑒定方法、致病性、致病因子、耐藥性及耐藥機(jī)制等方面進(jìn)行綜述，以期為更好的防范和治療CNS 相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 CNS 檢測鑒定技術(shù)研究

CNS 屬于革蘭氏陽性球菌，不產(chǎn)生血漿凝固酶，但可產(chǎn)生耐熱核酸酶，在血瓊脂平板上出現(xiàn)α、β或δ溶血。根據(jù)檢測原理的不同，CNS 的鑒定方法主要有表型鑒定和基因型鑒定兩類。表型鑒定方法，即傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)生化鑒定法主要包括API葡萄球菌檢測試紙條和BD 自動化微生物鑒定系統(tǒng)?；蛐丸b定方法主要有擴(kuò)增片段長度多態(tài)性指紋圖譜（AFLP）、16S rRNA 基因測序、PCR 法和全基因組DNA 雜交分析等。此外，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析法（MALDI-TOF MS）也可用于CNS 不同種屬的鑒定分析。但由于各種條件的限制，目前最常用的CNS 檢測鑒定方法有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)生化鑒定法、16S rRNA 基因測序比對法和PCR法等。

1.1 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)生化鑒定法

在葡萄球菌屬的生化鑒定方法中，最常見的是法國梅里埃公司旗下的API 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)根據(jù)某種細(xì)菌的特征生化反應(yīng)，能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行種或?qū)偎降蔫b定。根據(jù)API 軟件的操作說明，認(rèn)為當(dāng)鑒定結(jié)果的置信度大于80%的時候，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。然而，常規(guī)生化表型鑒定方法是葡萄球菌鑒定的初級方法，其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性有限，這主要是由于同種菌株間存在表型差異或突變。通常，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)生化鑒定法的準(zhǔn)確度較低，僅為50.0%～70.0%[10]。

1.2 16S rRNA 基因測序比對法

細(xì)菌的rRNA 是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA，包括5S、16S 和23S rRNA。其中16S rRNA 遺傳信息量適中，具有遺傳穩(wěn)定性，保守性高，結(jié)構(gòu)和功能具有高度保守性，被稱為細(xì)菌的“活化石”，是研究細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化和種屬鑒定的重要材料。郝俊璽等通過16S rRNA 基因測序比對，對60 份疑似CNS 菌株的樣品均鑒定到了種水平，鑒定準(zhǔn)確率達(dá)100.0%[11]。Kim 等通過16S rRNA 測序技術(shù)，對55 份葡萄球菌菌株進(jìn)行種屬水平的鑒定，也全部鑒定成功，并且所有受試菌株16S rRNA 檢測的同源性均在98.0%～100.0%[12]。該方法較傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)生化鑒定法的敏感性與準(zhǔn)確性均有所提高，但耗時長，對于親緣性關(guān)系相近的菌種辨別能力差。

1.3 PCR 法

通過對細(xì)菌的一種或多種高度保守的管家基因測序，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定病原菌的目的。在CNS 檢測鑒定方面，常用的目的基因有hsp60、gap、sodA、tuf 和rpoB 等[13]。Kim 等 通 過 設(shè) 計7 對 特 異 性sodA 基因引物，對CNS 進(jìn)行了種水平的鑒定，共鑒定出7種CNS 亞種[12]。Drancourt 等通過設(shè)計一對rpoB 基因通用引物，對29 株葡萄球菌進(jìn)行鑒定，均能準(zhǔn)確鑒定到不同的CNS 亞種水平，且不同菌株間rpoB 擴(kuò)增序列相似性為71.6%～93.6%，相比16S rRNA 鑒定方法，結(jié)果更準(zhǔn)確[14]?；诠芗一虻腜CR 方法的可靠性與16S rRNA 測序方法相同，但前者操作簡單，耗時短，并且葡萄球菌管家基因的分化程度往往高于16S rRNA，鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確。

2 CNS 的致病性研究

奶牛乳房炎是指奶牛乳腺組織受到病原微生物的侵襲而導(dǎo)致的乳腺組織炎癥，通常由葡萄球菌，鏈球菌和大腸桿菌等細(xì)菌引起[15]。根據(jù)臨床癥狀的不同，可將奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎，前者通常以肉眼可見的臨床癥狀為主，如乳房紅腫、硬結(jié)、血乳、乳汁水樣變性等，后者無明顯臨床表征，但乳汁體細(xì)胞數(shù)明顯升高，牛乳質(zhì)量和奶產(chǎn)量顯著降低。近些年來，CNS 已經(jīng)成為奶牛乳房炎頻繁暴發(fā)和流行的主要誘因，尤其對于奶牛隱性乳房炎而言，CNS 更是其最主要的病原菌，并導(dǎo)致乳腺持續(xù)性感染[5,16]。Piessens 等對134 份牛乳樣品的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)色葡萄球菌的分離率最高（30.6%），其次是溶血葡萄球菌（27.6%）和表皮葡萄球菌（11.9%）[17]。De Visscher 等研究表明，在300 份灌裝奶樣中，CNS 的檢出率達(dá)90.0%，其中馬胃葡萄球菌是CNS 的優(yōu)勢菌種，分離率占24.1%，其次是溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌，檢出率分別為12.9%和7.5%[16]。

3 CNS 的致病因子研究

3.1 BF

BF 是細(xì)菌產(chǎn)生的可以把細(xì)菌細(xì)胞包裹起來的網(wǎng)狀聚合基質(zhì)，主要成分是胞間粘附多糖（Polysaccha?ride of intercellular adhesion，PIA），此外還有BF 相關(guān)蛋白組分[18]。細(xì)菌首先吸附在物體表面，然后經(jīng)聚集、成熟和剝離形成三維結(jié)構(gòu)的聚合物，BF 的產(chǎn)生大大增強(qiáng)了CNS 對外界不良環(huán)境的抵抗力，對其在牛群之間的傳播和持續(xù)性感染至關(guān)重要[19-20]。BF 是CNS 最重要的毒力因子之一，由細(xì)胞間粘附基因座icaADBC 編碼合成，能阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬，保護(hù)細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和殺滅作用，此外還可阻礙抗菌藥物滲透進(jìn)入菌體[21-22]。Martins 等研究發(fā)現(xiàn)，在112 株CNS 菌株中，61.6%的CNS 能夠產(chǎn)生BF，操縱子icaADBC 的檢出率為8.9%[18]。Shrestha 等通過試管粘附法、剛果紅試驗(yàn)法和組織培養(yǎng)板法3 種方法檢測CNS 的BF 形成能力，結(jié)果顯示，71 株CNS 的BF 形成能力分別為82.0%、78.0%和71.8%[23]。BF 的形成是細(xì)菌的一種自我保護(hù)的毒力機(jī)制[24]。

3.2 腸毒素

葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE）是由葡萄球菌合成并分泌到細(xì)胞外的一類毒素物質(zhì)。SE 對熱有較高的耐受性，烹飪通常不能使其失活，即使巴氏消毒過程可以殺滅該病原菌，但其腸毒素的生理活性仍然存在，是引起食源性中毒的主要原因[25-26]。不同類型的腸毒素對熱耐受能力不同，但在100 ℃加熱30 min 條件下均不能完全破壞其活性，具體表現(xiàn)為B 型耐熱能力最強(qiáng)，C 型次之，A 型最差。通常，較常見的5 個經(jīng)典腸毒素有SEA、SEB、SEC、SED 和SEE，但近些年來，一些新的SE 種類相繼出現(xiàn)，包括SEG、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN 和SEQ 以及SER 等。de Frei?tas 等研究發(fā)現(xiàn)，在128 株CNS 菌株中，有66.0%的菌株攜帶腸毒素基因，腸毒素基因sea、seb和sec的攜帶率較高，其中sea 在CNS 中檢出率最高（35.1%）[27]。Piechota 等研究報道，經(jīng)典腸毒素基因在CNS 中的流行率為13.7%，部分CNS 同時攜帶2 種或者3 種腸毒素基因，其中sec 的檢出率高達(dá)70.0%[28]。

3.3 中毒休克綜合征毒素

中毒休克綜合征毒素（Toxic shock syndrome tox?in-1，TSST-1）是葡萄球菌相關(guān)超抗原毒力因子家族的主要成員之一，由tsst-1 基因編碼，是一種中毒性休克毒素，能使毛細(xì)血管的通透性增加，進(jìn)而造成心血管功能紊亂，導(dǎo)致機(jī)體局部甚至全身的中毒休克綜合征。Mahato 等對印度不同地區(qū)分離獲得的62 株CNS 的研究發(fā)現(xiàn)，僅2 株溶血性葡萄球菌中攜帶有tsst-1 基因，檢出率為3.2%[3]，與da Cunha 等人報道的tsst-1 檢出率為4.2%（5/120）基本一致[20]。但另有研究顯示，在分離自奶牛乳房炎的102 株CNS 中，并未檢測到TSST-1 超抗原編碼基因[29]，所以目前人們猜測TSST-1 可能通過某種機(jī)制調(diào)節(jié)CNS的致病性，而不是其關(guān)鍵的毒力因子。

3.4 脂肪酶

CNS 通常能產(chǎn)生3 種常見的脂肪酶，分別是GehC、GehD 和Geh-1，這3 種脂肪酶彼此之間序列高度相似，由4 個開放閱讀框編碼[9]。GehC、GehD和Geh-1 均以酶原前體的形式被分泌到細(xì)胞外，4個開放閱讀框的脂肪酶編碼基因也具有一定的相似性，可能在于不同的底物特異性，信號肽區(qū)和成熟脂肪酶區(qū)在各類脂肪酶蛋白中高度保守。通常認(rèn)為，前肽區(qū)對于成熟脂肪酶的正確折疊具有重要指導(dǎo)作用，不同脂肪酶之間其相似性較小，保守序列“SIRK”則起到高效輸出脂肪酶的作用。另外，鑒于脂肪酶GehC 和Geh-1 彼此的高度相似性（包括序列相似和功能相似），有人推測兩者可能不是受不同基因編碼，而是菌株突變的結(jié)果。脂肪酶可使細(xì)菌長期定植于人或哺乳動物皮膚的脂質(zhì)分泌物中，并通過阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用而發(fā)揮毒力作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶GehD 可以與膠原蛋白結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)可能為脂肪酶的致病性研究開辟了一條新的途徑[30]。

3.5 殺白細(xì)胞素

殺白細(xì)胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）是由LukS-PV 和LukF-PV 組成的雙組分成孔細(xì)胞毒素蛋白，經(jīng)胞內(nèi)合成并分泌到細(xì)胞外，然后組裝成穿孔七聚體，對嗜中粒細(xì)胞膜具有裂解效應(yīng)[31]。Mahato 等研究發(fā)現(xiàn)，pvl 基因在62 株CNS 中的檢出率為6.5%，其中松鼠葡萄球菌的攜帶率最高，占50.0%[3]。不同地區(qū)CNS 的pvl 攜帶率差異較大，孫垚等研究發(fā)現(xiàn)，在廣東部分地區(qū)分離的40 株奶牛乳房炎性CNS 中，并未檢測到pvl 基因[32]。

此外，層粘連蛋白，白細(xì)胞毒素，細(xì)胞毒性金屬蛋白酶，F(xiàn)A-修飾酶和耐熱核酸酶等也是CNS 常見的致病因子，當(dāng)機(jī)體受到病原菌侵襲時，這些因子往往協(xié)同作用于機(jī)體，造成動物感染發(fā)病。

4 CNS 的耐藥性與耐藥機(jī)制研究

近年來，由于臨床上抗生素的濫用造成的細(xì)菌耐藥現(xiàn)象引起了世界各國的高度關(guān)注，多重耐藥現(xiàn)象也越來越普遍。當(dāng)今，葡萄球菌抗生素耐藥性問題日益嚴(yán)重，是全球公共衛(wèi)生體系面臨的一個嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，深入開展葡萄球菌致病性和耐藥性研究，并科學(xué)、準(zhǔn)確的檢測病原菌的耐藥譜對規(guī)范臨床合理用藥，減少耐藥菌株的產(chǎn)生有著重要的指導(dǎo)意義。

4.1 耐藥性研究

在人源CNS 耐藥性研究方面，F(xiàn)owoyo 等對尼日利亞不同地區(qū)CNS 的調(diào)查研究表明，CNS 對氨芐西林的耐藥性最為嚴(yán)重，耐藥率達(dá)到86.7%，其次是磺胺甲噁唑-甲氧芐啶和阿莫西林克拉維酸鉀，耐藥率分別為74.9%和52.5%[33]；其中以表皮葡萄球菌對氨芐西林耐藥最嚴(yán)重，占92.0%，山羊葡萄球菌對氨芐西林耐藥率最低，為69.0%。同樣，Nanou?kon 等研究發(fā)現(xiàn)，在非洲西部地區(qū)，CNS 對臨床上常用的幾類抗生素也表現(xiàn)出較高的耐藥性，具體表現(xiàn)為對青霉素普遍耐藥，耐藥率為92.0%，對苯唑西林，頭孢西丁和磺胺甲噁唑-甲氧芐啶呈高度耐藥，耐藥率分別為74.0%、74.0%和72.0%，而所有CNS 菌株對呋喃妥因和利福平敏感，敏感性均在94.0%以上[34]。在牛源性CNS 耐藥性研究方面，Xu等對江蘇某奶牛場2012 年～2014 年間的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)CNS 菌株對青霉素產(chǎn)生了嚴(yán)重耐藥，耐藥率達(dá)86.8%，對紅霉素，鏈霉素和四環(huán)素表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的耐藥，耐藥率分別為48.7%、46.1%和39.5%，大多數(shù)CNS 菌株對慶大霉素和妥布霉素敏感，敏感性均在86.8%以上，此外對兩種以上抗生素耐藥的多重耐藥菌株占79.4%[35]。Breser 等研究結(jié)果表明，牛源CNS對青霉素的耐藥率最高，為85.0%，對紅霉素和氨芐西林的耐藥率也達(dá)到71.0%和57.0%，而對利福平敏感，敏感性為86.0%[36]。同時，董志民等報道指出，東北地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌對青霉素耐藥嚴(yán)重，耐藥率達(dá)70.0%[37]。

綜合看來，人源和牛源CNS 在耐藥譜上呈現(xiàn)出一定的相似性，表現(xiàn)為人源株和牛源株CNS 均對青霉素和氨芐西林產(chǎn)生了較高程度的耐藥，而對利福平敏感。

4.2 耐藥機(jī)制研究

在細(xì)菌耐藥性與抗菌藥物研發(fā)速度的競爭中，細(xì)菌往往具有更容易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，并且細(xì)菌耐藥性遺傳決定因子可在不同種屬的病原菌間傳播，進(jìn)而獲得表型耐藥，對大多數(shù)抗生素產(chǎn)生耐藥性[38-40]。CNS 對抗生素產(chǎn)生耐藥性通常由以下4 種途徑：改變藥物的靶向位點(diǎn)、酶的失活、降低細(xì)胞膜的通透性和外排泵介導(dǎo)的藥物外排[41]。細(xì)菌耐藥性機(jī)制為研究人員進(jìn)行科學(xué)研究提供了良好的細(xì)胞靶點(diǎn)來設(shè)計和開發(fā)新型抗菌藥物，細(xì)菌常見的耐藥機(jī)制如圖1 所示。

圖1 CNS 耐藥機(jī)制Fig.1 Resistance mechanism of CNS

5 小結(jié)與展望

在長期的進(jìn)化過程中，CNS 已經(jīng)形成了一套符合自身生存的各種耐藥因子與致病因子協(xié)調(diào)作用的宿主適應(yīng)機(jī)制。對CNS 進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定可以阻斷致病性CNS 的傳播，并有助于減少耐藥菌株的產(chǎn)生。分子鑒定技術(shù)能夠?qū)εR床上CNS 相關(guān)感染性疾病做出準(zhǔn)確的鑒別，分析是哪一種CNS 導(dǎo)致的機(jī)體患病，從而更加高效的制定治療方案。然而，CNS 種類繁多，每種CNS 亞種攜帶的毒力因子及其致病機(jī)制又存在差異，臨床研究中，應(yīng)查明具體的致病性CNS 菌種以及它們確切的作用機(jī)制，這雖然任重道遠(yuǎn)，但對于防控醫(yī)院和社區(qū)獲得性CNS 感染及人畜共患病的傳播意義重大，將極大提高人們的醫(yī)療和健康水平。因此，如何更加高效和準(zhǔn)確地對CNS 進(jìn)行檢測和鑒定將會是未來研究的方向，同時應(yīng)對不同種類CNS 致病因子進(jìn)行深入的研究。目前，哪些因子真正參與了CNS 對機(jī)體的致病性并以何種方式參與仍不清楚，這將會是未來一段時期內(nèi)科學(xué)家亟需解決的關(guān)鍵問題。因?yàn)镃NS 已經(jīng)對人類健康、獸醫(yī)臨床和食品安全等領(lǐng)域造成了巨大威脅和挑戰(zhàn)，所以深入開展CNS 致病因子與毒力因子作用機(jī)制研究顯得尤為重要。