婁欣宇，倪敬軒，林煒明

（1. 龍巖學(xué)院 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364012；2. 西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌402460；3. 福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的敗血癥是目前人類和動(dòng)物高死亡率的主要病因之一，大腸桿菌（E.coli）作為常見革蘭氏陰性菌對人和動(dòng)物的危害正逐年增加，如大腸桿菌早發(fā)性敗血癥（EOS）是新生兒（尤其是早產(chǎn)兒）死亡的重要原因[1]。近年來致病性E.coli 耐藥程度和發(fā)病率均呈現(xiàn)上升趨勢，病程愈發(fā)趨向于急性發(fā)作，但人們對其的重視和關(guān)注度卻有所下降。在對E.coli 的防治上一直受制于理想疫苗和藥物的缺乏，而開發(fā)高效、快速、安全的藥物以提升對大腸桿菌病的防控效果具有重要意義。

病原體侵入機(jī)體后，固有免疫系統(tǒng)在早期免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)損傷相關(guān)分子模式（DAMP）和病原相關(guān)分子模式（PAMP）可以激活受到E.coli 攻擊的固有免疫系統(tǒng)，促使機(jī)體在感染早期發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[2]，而炎癥反應(yīng)的過度和失控，通常會(huì)導(dǎo)致組織損傷和器官衰竭。因此，固有免疫系統(tǒng)能否在抗原侵入早期做出適度的應(yīng)答，以有效控制病原體的數(shù)量和炎癥反應(yīng)，對防控E.coli感染具有十分重要的意義。

魚精蛋白（PP）是一種主要存在于魚類成熟精子細(xì)胞核中的堿性蛋白質(zhì)。PP 具有良好的吸附和緩釋作用，它可與其它多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成不同的蛋白復(fù)合物，如能與胰島素結(jié)合，延遲甚至阻止胰島素的釋放，延長其降血糖作用[3]。將抗菌制劑與PP 進(jìn)行復(fù)配，可以在很大程度上延長藥效，進(jìn)而減少藥物的用量，降低制藥成本[4]。此外，天然提取的PP因成分復(fù)雜而具有較強(qiáng)的免疫原性，已有研究表明PP 作為抗原載體可以顯著增加小鼠的免疫應(yīng)答[5]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究證明PP 具有快速促進(jìn)卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的作用，極顯著提高E. coli 疫苗的免疫效力[6]，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。在此基礎(chǔ)上本研究就PP 對E.coli 感染小鼠的早期免疫保護(hù)作用進(jìn)行研究，以期為PP 在臨床防治E.coli 急性感染中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料致病性E.coli（CVCC1477）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；8 周齡～9 周齡（22 g～24 g）清潔級ICR 雌性小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于IVC 獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具。硫酸PP購自Sigma 公司；內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；MiniBEST RNA 快速提取試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和TB GreenTMPremix ExTaqTMII（TliRNaseH Plus）試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 E.coli 致死量的確定將50 只雌性ICR 小鼠隨機(jī)分成5 組，每組10 只。第1～4 組分別腹腔注射E.coli 菌液5×107cfu/0.2 mL/只、1×107cfu/0.2 mL/只、2×106cfu/0.2 mL/只和4×105cfu/0.2 mL/只，第5 組注射等量生理鹽水作為空白對照。注射后1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h 觀察小鼠的精神狀態(tài)和死亡情況，計(jì)算E.coli 致死量。

1.3 小鼠攻菌保護(hù)試驗(yàn)將20 只小鼠隨機(jī)分為2組，每 組10 只。PP 組 皮 下 注 射PP 100 μg/0.2 mL/只，攻菌對照組皮下注射等體積生理鹽水，7 d 后腹腔注射致病性E.coli 菌液0.2 mL（含活菌1×107cfu），連續(xù)48 h 觀察小鼠發(fā)病情況并記錄死亡時(shí)間。

1.4 攻菌后小鼠外周血、脾臟、肝臟細(xì)菌載量的檢測將16 只小鼠隨機(jī)分為2 組，每組8 只。PP 組皮下注射PP 100 μg/0.2 mL/只，攻菌對照組皮下注射等體積生理鹽水。7 d 后腹腔注射亞致死劑量E.coli菌液0.2 mL（含活菌2×106cfu）。攻菌后12 h、48 h 采集所有小鼠眼眶靜脈血0.2 mL，并于第二次（48 h）采血完成后迫殺，無菌采集部分肝臟、脾臟，研磨后用1 mL PBS 制成組織勻漿，稀釋后涂布于LB 瓊脂平板，于37 ℃培養(yǎng)，24 h 后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。

1.5 攻菌后小鼠外周血脂多糖（LPS）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量的檢測將24 只小鼠隨機(jī)分為3 組，每組8 只。PP 組皮下注射PP 100 μg/0.2 mL/只，攻菌對照組和空白組皮下注射等體積生理鹽水。7 d 后腹腔注射亞致死劑量E.coli 菌液0.2 mL（含活菌2×106cfu），空白組皮下注射等體積生理鹽水。攻菌后分別于12 h、48 h 采集所有小鼠眼眶靜脈抗凝血0.2 mL，按照內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒說明，利用試管定量顯色基質(zhì)法檢測小鼠外周血中LPS 含量；攻菌后48 h 采集所有小鼠眼眶靜脈血1 mL，用IDEXX Catalyst One 全自動(dòng)動(dòng)物生化分析儀進(jìn)行血液生化檢測，主要檢查外周血中ALT 的變化情況。

1.6 攻菌后小鼠脾臟炎癥因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.5。攻菌后48 h 迫殺小鼠，無菌取其脾臟（約20 mg）剪碎放入離心管中，采用MiniBEST RNA 快速提取試劑盒提取小鼠脾臟總RNA。調(diào)整OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0 的樣品RNA 濃度為1 μg/μL，使用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用ABI Step One Plus 熒光定量PCR儀，以β-actin 為內(nèi)參基因，檢測小鼠脾臟中炎癥因子（IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TLR4、NF-κB、IRF3、IRF7）的相對轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算。依據(jù)GenBank 收錄的序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)合成IRF3、IRF7 的特異性引物，其余引物參考文獻(xiàn)[7-9]合成（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.7 數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析和獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；利用Graph Pad Prism 7 軟件中Long-rank 進(jìn)行存活率統(tǒng)計(jì)分析。p<0.05 代表組間差異顯著；p<0.01代表組間差異極顯著。

表1 引物序列表Table 1 The primer sequences

2 結(jié) 果

2.1 E.coli 致死量的確定利用小鼠模型確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所需致死劑量。結(jié)果如圖1 所示，當(dāng)攻菌劑量≥1×107cfu/只時(shí)，24 h 內(nèi)的死亡率為100%；當(dāng)攻菌劑量為2×106cfu/只時(shí)，36 h 內(nèi)的死亡率為80%；當(dāng)攻菌劑量為4×105cfu/只時(shí)，36 h 內(nèi)的死亡率為10%（圖1）。因此，后續(xù)試驗(yàn)分別將1×107cfu/只和2×106cfu/只作為致死劑量和亞致死劑量。

2.2 小鼠攻菌保護(hù)試驗(yàn)對小鼠PP 注射7 d 后利用致死劑量E.coli 菌液進(jìn)行攻菌，結(jié)果顯示，對照組小鼠感染后4 h 開始發(fā)病，臨床表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸急促、被毛逆立，6 h 開始死亡，28 h 內(nèi)全部死亡。PP 組小鼠于30 h、36 h 各死亡1 只，其余小鼠逐漸全部恢復(fù)，與對照組相比差異極顯著（p<0.01）（圖2）。表明PP 能夠明顯增強(qiáng)小鼠對致死性E.coli感染的抵抗力。

圖1 不同劑量E.coli 注射對小鼠存活率的影響Fig.1 The effects of different dose of E.coli injection on the survival of mice

圖2 攻菌后的小鼠存活率Fig.2 The survival of mice challenged with E.coli

2.3 攻菌后小鼠外周血、脾臟和肝臟的細(xì)菌載量PP 注射7 d 后用亞劑量E.coli 菌液給小鼠腹腔注射，檢測攻菌后12 h 和48 h 小鼠外周血及其肝臟、脾臟中的細(xì)菌載量。結(jié)果顯示，PP 組小鼠在攻菌后12 h和48 h 時(shí)其外周血細(xì)菌載量均極顯著低于攻菌對照組（p<0.01）。在12 h～48 h 攻菌對照組死亡3 只，PP 組死亡1 只。攻菌后48 h PP 組小鼠脾臟及肝臟中細(xì)菌載量均極顯著低于攻菌對照組（p<0.01）（圖3）。表明PP具有增強(qiáng)機(jī)體清除外來E.coli 感染的作用。

圖3 攻菌后小鼠外周血（A）、肝臟和脾臟（B）細(xì)菌載量Fig.3 The bacterial loads in blood(A),spleen and liver(B)of mice after challenge

2.4 攻菌后小鼠外周血LPS 含量利用試管定量顯色基質(zhì)法檢測小鼠外周血中LPS 含量，結(jié)果顯示，E. coli 攻菌后12 h，攻菌對照組小鼠外周血中LPS 含量極顯著高于空白對照組（p<0.01），而PP 組LPS 濃度雖然顯著高于空白對照組（p<0.05），卻極顯著低于攻菌對照組（p<0.01）；E.coli 感染后48 h，攻菌對照組小鼠外周血LPS 濃度仍極顯著高于空白對照組（p<0.01），而PP 組LPS 濃度已降至與空白對照組無顯著差異（圖4）。表明PP 能通過促進(jìn)機(jī)體對E.coli 的清除作用，進(jìn)而降低攻菌所致小鼠外周血中LPS含量，最終增強(qiáng)小鼠抗E.coli感染的能力。

2.5 攻菌后小鼠外周血中ALT 含量PP 給藥7 d 后對小鼠腹腔注射亞劑量E.coli 菌液，檢測攻菌后48 h小鼠外周血中ALT 含量。結(jié)果顯示，攻菌對照組外周血ALT 水平極顯著高于空白對照組和PP 組（p<0.01），PP 組ALT 水 平 與 空 白 對 照 組 無 顯 著 差 異（p>0.05）（圖5）。表明PP能夠降低攻菌所致小鼠外周血ALT的升高，提示PP可能具有一定的保護(hù)肝臟的作用。

圖5 攻菌后48 h 小鼠血液ALT 含量Fig.5 The content of ALT in blood of mice at 48 h after challenge

2.6 攻菌后小鼠脾臟細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平PP給藥7 d后對小鼠腹腔注射亞劑量E.coli菌液，檢測攻菌后48 h 小鼠脾臟中與LPS-TLR4 通路相關(guān)的細(xì)胞因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，攻菌對照組中IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-10、TLR4、IRF7 的轉(zhuǎn)錄水平相較空白對照組均極顯著升高（p<0.01）；PP 組中IL-6、TLR4、IFN-β和IRF7的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相較于攻菌對照組發(fā)生了極顯著下調(diào)（p<0.01），且IL-1β和IL-10 的mRNA 轉(zhuǎn) 錄 水 平 發(fā) 生 了 顯 著 下 調(diào)（p<0.05）（圖6）。表明當(dāng)機(jī)體受到E.coli 攻擊時(shí)會(huì)引起相關(guān)炎癥因子的過度表達(dá)，而PP 一方面可降低TLR4 及其下游炎癥基因的表達(dá)，另一方面可下調(diào)IRF7 和IFN-β的表達(dá)以降低機(jī)體對細(xì)菌攻擊的敏感性，在急性感染早期起到有效控制炎癥反應(yīng)程度的作用。

圖6 攻菌后48 h 小鼠脾臟細(xì)胞因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 The mRNA transcription of cytokines in the spleen of mice at 48 h after challenge

3 討 論

攻毒保護(hù)率是評價(jià)藥物抵御病原體攻擊能力的重要指標(biāo)，在感染發(fā)生初期抑制病原體侵入的數(shù)量和規(guī)模對于病程的控制十分重要。E.coli 侵入機(jī)體后會(huì)迅速進(jìn)入血液循環(huán)并釋放LPS 誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)，而血液、脾臟、肝臟等器官中的細(xì)菌載量，以及血液中LPS 含量可以反映機(jī)體抵御和清除細(xì)菌的能力。肝臟是動(dòng)物機(jī)體最重要的代謝與解毒器官，ALT 是反映肝臟損傷的重要指標(biāo)，其含量升高程度與肝臟受損呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，PP 注射后7 d 對E.coli 急性感染小鼠具有較好的保護(hù)作用，這可能與PP 通過增強(qiáng)機(jī)體對細(xì)菌清除能力，從而有效控制E.coli 感染后的病程發(fā)展有關(guān)。

LPS 作為E. coli 主要致病因子之一，主要通過LPS-TLR4 通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TLR4 參與組成抗擊外來病原的第一道防線[10]，有研究顯示TLR4 基因敲除小鼠可以避免死于E. coli 敗血癥[11]，說明LPS 與TLR4 結(jié)合后很可能是LPS-TLR4 上游信號通路的“高危傳感器”。NF-κB 是這條通路中重要的下游通路，可調(diào)節(jié)許多炎癥因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，抑制其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能拯救小鼠免于致死性內(nèi)毒素休克[12]。IL-1β、IL-6 可誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，IL-10 能阻斷NF-κB 活性，并參與調(diào)節(jié)JAK-STAT 信號通路。TLR4 可同時(shí)啟動(dòng)MyD88 依賴和TRIF 依賴兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，MyD88 可活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和AP-1引起促炎癥基因轉(zhuǎn)錄，TRIF 通過激活I(lǐng)RF 家族中的IRF3 和IRF7 誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素基因表達(dá)。有研究表明IRF3 和IRF7 在對Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)生成中起到相互補(bǔ)充的作用，但后期Ⅰ型干擾素的高表達(dá)由IRF7 主導(dǎo)[13]。Ⅰ型干擾素有助于宿主清除病毒，增加宿主對細(xì)菌攻擊的易感性[14]，但在炎癥反應(yīng)失控時(shí)，響應(yīng)感染產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素將會(huì)增強(qiáng)LPS 的致死作用，損傷機(jī)體[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PP 能夠下 調(diào) 攻 菌 所 致 的IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-β、TLR4、IRF7 等因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的過度升高，從而在源頭上避免早期急性感染期間炎癥反應(yīng)失控和“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生。

綜上所述，PP 能快速誘導(dǎo)小鼠對致病性E.coli的抵抗力，增強(qiáng)機(jī)體抵御和清除外來病菌的能力，以保護(hù)動(dòng)物應(yīng)對E.coli 的早期急性感染。其作用機(jī)理與調(diào)控LPS-TLR4 通路相關(guān)炎癥因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄有關(guān)。因此，預(yù)防性接種PP 可以通過對機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)控以增強(qiáng)動(dòng)物自身的抗感染能力，使其即便感染也能通過機(jī)體自身調(diào)整以恢復(fù)健康，從而避免抗生素等藥物的使用，在一定程度上彌補(bǔ)市面上尚無廣譜有效的大腸桿菌疫苗的不足。這值得作為一種新的防治大腸桿菌病的方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。