孫 銳，姜 明，曹玉凱，劉天艷，郭笑辰，孫 旭，周金鑫，王 楠，康 凱，尹杰超，任桂萍,，肖 偉，李德山,

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222002）

雞傳染性法氏囊?。↖BD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的急性接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。疫苗接種是預(yù)防IBD 流行的最主要措施。目前應(yīng)用最為廣泛的疫苗主要是減毒疫苗[2]，雖然減毒疫苗免疫原性好，但接種后對(duì)法氏囊產(chǎn)生一定破壞作用，損害雞體免疫系統(tǒng)，從而影響其它疫苗的免疫效果[3]。

為了避免減毒疫苗的毒副作用，特別是在發(fā)病后及時(shí)治療，卵黃抗體應(yīng)運(yùn)而生，并在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，且早期治療療效可達(dá)90%以上[4]。由于疫苗接種后不能馬上產(chǎn)生抗體，注射卵黃抗體可以填補(bǔ)疫苗接種之后抗體產(chǎn)生之前的空白階段，使雞體得到有效保護(hù)[5]。然而卵黃抗體在使用過(guò)程中也存在一些不可避免的弊端，如可能攜帶卵源傳染病病原[5]，如雞傳染性腦炎、減蛋綜合癥、禽淋巴白血病、大腸桿菌、支原體、沙門(mén)氏菌等病原等，病毒如果滅活不夠徹底，將會(huì)造成疾病的垂直傳播，并且卵黃抗體中含有較多的磷脂及脂肪，注射后易引起雞體的不適，造成肌肉腫脹、出血、壞死以及應(yīng)激和過(guò)敏反應(yīng)[6-7]。此外，生產(chǎn)卵黃抗體需要飼養(yǎng)一大批產(chǎn)卵雞，并要不斷維持法氏囊的抗體水平，從卵黃中提取抗體，程序復(fù)雜，成本較高，嚴(yán)重限制卵黃抗體的應(yīng)用。

為解決上述卵黃抗體的瓶頸問(wèn)題，本研究將基因工程抗體技術(shù)和病毒反向遺傳操作技術(shù)相結(jié)合，將具有中和作用的雞源單克隆抗體插入到新城疫病毒（NDV）LaSota 株基因組中，獲得主動(dòng)免疫與被動(dòng)免疫相結(jié)合的表達(dá)IBDV 抗體的重組NDV，并對(duì)其免疫保護(hù)效果進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NDV LaSota rClone30株、pNDV 質(zhì)粒、pT19-VP2-IRES-VP2、prNDV-IB?DV（P/M）重組質(zhì)粒、prTM1-NP、prTM1-P、prTM1-L輔助質(zhì)粒以及感受態(tài)E.coli DH5 株、感受態(tài)STBL-2株、BHK-21 細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞DF-1、IBDV 經(jīng)典株（BC6/85 株）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；14 日齡無(wú)特定病原體（SPF）雞、9 日齡～11 日齡SPF 胚胎均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑VP2 蛋白（具有IBDV 抗體的中和表位）、IBDV-40 是基因工程全長(zhǎng)抗體[5]（通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)證明具有中和IBDV 的抗體，在本實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照抗體） 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；dNTP Mixture、Oligo（dT）18、DNA Marker、T4 DNA 連接酶、pMD18-T載體、限制性?xún)?nèi)切酶、rTaq DNA 聚合酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Tiangen 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；雞傳染性法氏囊病精致高免蛋黃抗體購(gòu)自普萊柯生物工程有限公司；病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自Promega 公司；In-fusion HD kits 無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自Clontech 公司；兔抗VP2 的多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；HRP 標(biāo)記的羊抗雞IgG 及羊抗兔IgG 均購(gòu)自Southern Biotech 公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以prNDV-IBDV（P/M）為模板，通過(guò)Primer 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。分別采用L（P/M）-（F/R）、L（NP/P）-（F1/R1）引物PCR擴(kuò)增L基因。采用H（P/M）-（F2/R2）、H（NP/P）-（F3/R3）擴(kuò)增H 基因。將其克隆至pMD18-T 載體中，將測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pMD18-L（P/M）、pMD18-L（NP/P）、pMD18-H（P/M）、pMD18-H（NP/P）。將pNDV 載體和pMD18-H（P/M）質(zhì)粒分別用Pme I、Sac II 限制酶酶切連接后轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為prNDV-H（P/M）（圖1A）；重組質(zhì)粒prNDV-H（NP/P）（圖1B）的構(gòu)建方法同上；將prNDV-H（NP/P）載體和pMD18-L（P/M）質(zhì)粒分別用Pme I、Sac II 酶切連接后轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為prNDV-H（NP/P）-L（P/M）（圖1C）；重組質(zhì)粒prNDV-L（NP/P）-H（P/M）（圖1D）的構(gòu)建方法參照prNDV-H（NP/P）-L（P/M）；為 了 獲 得 重 組 質(zhì) 粒prNDV-IRES-H-L（P/M），以prNDV-IBDV（P/M）為模板，采用H（F4/R4）擴(kuò)增H 基因片段，引物序列見(jiàn)表1，將其克隆至pMD18-T 載體上，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD18-H（F4/R4），將pT19-VP2-IRESVP2 載體和pMD18-H（F4/R4）質(zhì)粒分別用EcoR I 和Mlu I 酶切連接后轉(zhuǎn)化，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pT19-VP2-IRES-H（F4/R4）， 將pNDV 載 體 和pMD18-L（P/M）質(zhì)粒分別用Pme I、Sac II 限制酶酶切連接后轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為prNDV-L（P/M），將prNDV-L（P/M）載體用Apa I 和Aat II 酶切后回收純化載體，pT19-VP2-IRES-H（F4/R4）質(zhì)粒通過(guò)引 物（F5/R5）PCR 擴(kuò)增IRES-H 基因，將純化后的載體與純化后的IRES-H 片段，通過(guò)In-fusion HD kits 無(wú)縫克隆試劑盒連接轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒鑒定將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為prNDV-IRES-H-L（P/M）（圖1E）。

圖1 重組NDV 基因組DNA 的構(gòu)建Fig.1 The construction of recombinant NDV genomic DNA

1.4 重組病毒的拯救采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，分別將重組質(zhì)粒prNDV-IRES-H-L（P/M）、prNDV-H（NP/P）-L（P/M）、prNDV-L（NP/P）-H（P/M）、prNDV-H（P/M）、prNDV-H（NP/P）和prTM1-NP、prTM1-P、prTM1-L共轉(zhuǎn)染至六孔板內(nèi)，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%的BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染孵育72 h 后，將BHK-21 細(xì)胞在-80 ℃反復(fù)凍融3 次。將上清液接種到9 日齡～11 日齡的SPF 雞蛋的尿囊腔中。72 h 后，收集并混合尿囊液后進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)。收獲HA 試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的尿囊液，將重組病毒分別命名為rNDV-H（NP/P）、rNDV-H（P/M）、rNDV-IRES-H-L（P/M）、rNDVH（NP/P）-L（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）。

1.5 重組病毒的RT-PCR 鑒定利用病毒RNA 提取試劑盒從拯救的病毒感染的SPF 雞卵的尿囊液中提取總RNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cD?NA。將cDNA 用作模板，利用NP/P-（F6/R6）、P/M-（F7/R7）位點(diǎn)引物通過(guò)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增H 和L 基因，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序以鑒定插入保真度。

1.6 重組病毒的生物活性檢測(cè)為了進(jìn)一步確定重組病毒的生物學(xué)活性，分別對(duì)重組病毒的HA、TCID50、EID50、雞胚平均致死時(shí)間（MDT）、腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）[8-9]等生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the present study

1.7 重組病毒生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將MOI 0.01病毒感染接種于六孔板內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DF-1 細(xì)胞，其培養(yǎng)液為DMEM（5%胎牛血清）。37 ℃培養(yǎng)數(shù)天，每間隔24 h 收獲上清液，分別測(cè)定收獲上清的TCID50。繪制重組病毒在DF-1 細(xì)胞中同步生長(zhǎng)曲線。

1.8 重組病毒中H 基因或融合H 和L 基因表達(dá)的western blot 檢測(cè)取純化后的VP2（1.31 mg/mL）經(jīng)15% SDS-PAGE 電泳后，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，分別以MOI 0.1 重組病毒感染的DF-1 細(xì)胞收獲的上清液以及IBDV-40（1.001 mg/mL）作為一抗，羊抗雞IgG-HRP（1:7 500）為二抗，利用ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑曝光顯影，western blot 檢測(cè)重組病毒中H 基因或融合H 和L 基因的表達(dá)情況。

1.9 重組病毒中H 基因或融合H 和L 基因表達(dá)的ELISA 檢測(cè)將IBDV-40（濃 度 為1.001 mg/mL）、rNDV-IRES-H-L（P/M）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）、rNDV-H（NP/P）、NDV 各100 μL 包被于96 孔板。以兔抗VP2多克隆抗體為一抗（1:6 000），羊抗兔IgG-HRP（1:7 500），采用本實(shí)驗(yàn)室建立的ELISA 方法檢測(cè)。設(shè)置只加底物的PBS 組為背景對(duì)照、未加VP2 的陰性對(duì)照1（MOCK1）和未加兔抗VP2 多克隆抗體的陰性對(duì)照2（MOCK2），樣品及對(duì)照均設(shè)置了3 個(gè)平行孔。

1.10 IBDV 抗體和NDV 特異性抗體的檢測(cè)將32只14 日齡的SPF 雞隨機(jī)分為4 組，每組8 只，分別是NDV 組、rNDV-H（P/M）組、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組、空白組。按108EID50劑量的重組病毒免疫實(shí)驗(yàn)雞，于免疫后的1 d、3 d、5 d 抽取雞血分離血清，通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)IBDV 抗體[10]；于免疫后的7 d、14 d、21 d 抽取雞血分離血清，檢測(cè)雞NDV 特異性抗體效價(jià)（HI），具體檢測(cè)方法及步驟參考文獻(xiàn)[11-12]。

1.11 重組病毒對(duì)感染雞的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)將48 只14 日齡的SPF 雞隨機(jī)分為6 組，每組8 只，分別是NDV 組、rNDV-H（P/M）組、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組、空白組、感染未預(yù)防組（感染IBDV BC6/85）、卵黃抗體組。NDV 組、rNDV-H（P/M）組、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組雞只按108EID50劑量的重組病毒免疫實(shí)驗(yàn)雞，卵黃抗體組注射1 mg 抗體?？瞻捉M用0.9%生理鹽水代替，感染未預(yù)防組只感染未預(yù)防，免疫7 d后，用104EID50劑量的IBDV BC6/85 攻擊免疫雞，每天觀察所有的SPF雞臨床癥狀，感染未預(yù)防4 d后，稱(chēng)量每只雞的體重以及法氏囊重用于囊體比[囊體比=法氏囊重（g）/體重（g）×1 000]，觀察法氏囊損傷情況進(jìn)行評(píng)分（標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)各組實(shí)驗(yàn)雞法氏囊的萎縮程度0：沒(méi)有損傷，1：微弱變化，2：小于25%囊損傷，3：26%～50%的濾泡損傷，4：51%～75%濾泡損傷，5：76%～100%囊損傷），并計(jì)算保護(hù)率（保護(hù)率=法氏囊病理?yè)p傷評(píng)分為0 和1 的實(shí)驗(yàn)雞個(gè)數(shù)/該組實(shí)驗(yàn)雞總數(shù)×100%），然后對(duì)法氏囊進(jìn)行病理切片分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果構(gòu)建的重組質(zhì)粒prNDV-IRES-H-L（P/M）、prNDV-H（NP/P）-L（P/M）、prNDV-L（NP/P）-H（P/M）、prNDV-H（P/M）、prNDV-H（NP/P）通過(guò)PCR 或酶切鑒定，獲得目的片段，其測(cè)序結(jié)果顯示，H、L 和IRES-H 大小分別為1 770 bp、750 bp 和2 350 bp, 與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。表明上述重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒中目的片段的PCR 或酶切鑒定Fig.2 PCR or restriction enzyme analysis of prNDVs

2.2 重組病毒的拯救分別將prNDV-IRES-H-L（P/M）、prNDV-H（NP/P）-L（P/M）、prNDV-L（NP/P）-H（P/M）、prNDV-H（P/M）和prNDV-H（NP/P）通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)從cDNA 水平拯救出具有感染性的重組病毒粒子。HA 實(shí)驗(yàn)和HI 實(shí)驗(yàn)分析顯示同樣呈現(xiàn)陽(yáng)性，不同雞胚的HA 效價(jià)介于28～211。收獲的陽(yáng)性尿囊液作為重組NDV rNDV-IRES-H-L（P/M）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）、 rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）和rNDV-H（NP/P）的F1 代。

2.3 重組病毒的RT-PCR 鑒定利用病毒RNA 提取試劑盒提取重組病毒RNA。以NDV 為陰性對(duì)照，用基因組的上游和下游引物對(duì)重組病毒中插入的相應(yīng)片段進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示重組病毒均能夠擴(kuò)增出相應(yīng)目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，片段大小與預(yù)期相符（圖3）。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果正確（數(shù)據(jù)未顯示）。

2.4 重組病毒生物學(xué)特性的檢測(cè)對(duì)NDV和5種重組病毒（第4 代）進(jìn)行了HA、TCID50、EID50、MDT、ICPI等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與親本NDV 相比，重組病毒的HA，EID50及TCID50滴度均未見(jiàn)明顯差異（表2），表明重組病毒依舊保持了其親本病毒的感染能力和生物學(xué)特性；MDT 結(jié)果顯示重組病毒的平均致死時(shí)間均大于120 h（>120 均屬于弱毒株），表明重組病毒均屬于弱毒株范圍；更重要的毒力指標(biāo)ICPI 則進(jìn)一步顯示重組病毒的ICPI 值均為0。以上結(jié)果表明，重組病毒不僅保持了其親本NDV 的感染能力而且還保持了其弱毒株的生物學(xué)特性。

圖3 重組NDV 外源基因的RT-PCR 鑒定Fig.3 Identification of the exogenous genes in the recombinant vial genomes by RT-PCR

表2 病毒滴度和毒力的比較Table 2 Comparations of virus titer and pathogenicity

2.5 重組病毒生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將5 種重組病毒及親本病毒分別按MOI 0.01 感染DF-1 單層細(xì)胞，每間隔24 h收集樣品檢測(cè)TCID50（圖4）。結(jié)果顯示重組病毒rNDV-IRES-H-L（P/M）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）、rNDV-H（NP/P）與NDV 親本病毒株生長(zhǎng)特性基本一致，表明外源基因的插入對(duì)病毒的復(fù)制能力無(wú)顯著影響。

2.6 重組病毒中H 基因或融合H 和L 基因表達(dá)的western blot 檢測(cè)結(jié)果Western blot 測(cè)檢重組病毒中H 基因或融合H 和L 基因的表達(dá)，結(jié)果顯示IB?DV-40、rNDV-IRES-H-L（P/M）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）、rNDV-H（NP/P）均能與VP2 蛋白結(jié)合，而NDV 則不能與VP2 蛋白結(jié)合（圖5）。表明rNDV-IRES-H-（P/M）、rNDV-IRES-L-H（P/M）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）、rNDVH（NP/P）中H 基因或融合H 和L 基因正確表達(dá)，且rNDV-L（NP/P）-H（P/M）中融合H 和L 基因和rNDVH（P/M）中H 基因表達(dá)量高。

圖4 重組病毒在DF-1 細(xì)胞復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 The growth curve of recombinant viruses in DF-1 cells

圖5 Western blot 檢測(cè)外源基因的表達(dá)Fig.5 The expression of foreign gene detected by western blot

2.7 重組病毒中H 基因或融合H 和L 基因表達(dá)的ELISA 檢測(cè)結(jié)果采用ELISA 法檢測(cè)重組病毒中H基因或融合H 和L 基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，NDV（OD450nm=0.177），NDV-IRES-H-L（P/M）（OD450nm=0.577）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）（OD450nm=0.589）、 rNDV-L（NP/P）-H（P/M）（OD450nm=0.858）、rNDV-H（P/M）（OD450nm=0.793）、rNDV-H（NP/P）（OD450nm=0.650）。分析可得，NDV-IRES-H-L（P/M）、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）、rNDV-H（NP/P）中外源基因的表達(dá)量與NDV 相比差異極顯著（p<0.01）（圖6）。表 明rNDV-H（P/M）中H 基 因 和rNDV-L（NP/P）-H（P/M）中融合H和L基因表達(dá)量高。

2.8 NDV 特異性抗體效價(jià)的檢測(cè)為測(cè)定表達(dá)量高的重組病毒在雞體內(nèi)產(chǎn)生NDV 特異性抗體的情況，于免疫后的7 d、14 d、21 d 抽取雞血，測(cè)定（HI），結(jié)果顯示，NDV 組、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組和rNDV-H（P/M）組的整體抗體水平在14 d 達(dá)到最高，21 d 略有下降，但高于7 d 的平均HI 抗體效價(jià)；在免疫14 d 和21 d 后，NDV 組、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組和rNDV-H（P/M）組的HI 抗體效價(jià)均達(dá)到保護(hù)臨界值（4log2），HI抗體效價(jià)與PBS組成差異極顯著（p<0.01）（圖7），表明重組病毒能夠有效刺激SPF雞產(chǎn)生NDV特異性抗體且達(dá)到一定的保護(hù)效果。

圖6 ELISA 檢測(cè)外源基因的表達(dá)Fig.6 The expression of foreign genes detected by ELISA

圖7 免疫雞體內(nèi)NDV 特異性抗體水平變化情況（log2）Fig.7 The levels of NDV-specific antibodies in immunized chickens(log2)

2.9 IBDV 特異性抗體效價(jià)的檢測(cè)為測(cè)定重組病毒在雞體內(nèi)產(chǎn)生IBDV 特異性抗體的情況，于免疫后1 d、3 d、5 d 抽取雞血分離血清，通過(guò)ELISA 測(cè)定雞體內(nèi)產(chǎn)生IBDV 特異性抗體的效價(jià)，結(jié)果顯示，免疫第1 d、3 d、5 d rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組OD450nm值 分 別 為0.211、0.441、0.439；rNDV-H（P/M）組OD450nm值分別為0.210、0.436、0.393；NDV 組OD450nm值 分 別 為0.090、0.093、0.089。rNDV-H（P/M）組和rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組在免疫后第2 d OD450nm值開(kāi)始升高，且在3 d～5 d 抗體水平持續(xù)上升；而NDV 組OD450nm值未有顯著變化。分析可得rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組和rNDV-H（P/M）組抗體效價(jià)與NDV 組相比差異極顯著（p<0.01）（圖8）。表明重組病毒能在SPF 雞體內(nèi)產(chǎn)生IBDV 抗體。

2.10 重組病毒對(duì)感染雞的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用重組病毒對(duì)感染IBDV BC6/85 株雞只進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)后，各組實(shí)驗(yàn)雞的囊體比、法氏囊損傷評(píng)分及保護(hù)率結(jié)果如表3 所示，結(jié)果顯示rNDV-H（P/M）組、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組的囊體比分別為（1.72±0.34）和（2.09±0.21），與NDV 組和感染未預(yù)防組的囊體比（0.83±0.34）和（0.85±0.43）相比明顯升高；同時(shí)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)雞法氏囊的病理?yè)p傷程度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果表明感染未預(yù)防組和NDV 組實(shí)驗(yàn)雞IBD的感染率為100%，其它組保護(hù)率順序?yàn)檎＝M>rNDV-H（P/M）>卵黃抗體>rNDV-L（NP/P）-H（P/M）表3。取感染后雞法氏囊組織制作病理切片，HE染色結(jié)果顯示，空白組無(wú)明顯變化。rNDV-H（P/M）組、rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組和卵黃抗體組法氏囊損傷程度明顯比感染未預(yù)防組和NDV 組輕。感染未預(yù)防組和NDV 組法氏囊淋巴結(jié)體積縮小，皮質(zhì)髓質(zhì)大量淋巴細(xì)胞凋亡，腔內(nèi)大量可見(jiàn)炎癥細(xì)胞及變性壞死細(xì)胞。rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組和卵黃抗體組部分區(qū)域出現(xiàn)炎癥細(xì)胞及變性壞死細(xì)胞；相比rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組和卵黃抗體組，rNDV-H（P/M）組法氏囊損傷程度比rNDV-H（NP/P）-L（P/M）組和卵黃抗體組輕（圖9）。表明rNDV-H（P/M）的保護(hù)效果好。

圖8 ELISA 檢測(cè)免疫雞體內(nèi)IBDV 抗體Fig.8 The detection of anti-IBDV antibody in immunized chickens by ELISA

表3 各組實(shí)驗(yàn)雞抵抗IBDV(BC6/85 株)感染的保護(hù)效力Table 3 Protection efficacy of different treatment against IBDV(BC6/85 strain)challenge in chickens

圖9 各組部分法氏囊HE 結(jié)果Fig.9 HE staining of bursal of Fabricius in each group

3 討 論

本研究對(duì)所構(gòu)建的重組病毒免疫效果進(jìn)行了探究，在NDV 抗體水平方面，HI 結(jié)果顯示重組病毒均能在免疫后的14 d 達(dá)到保護(hù)臨界值，說(shuō)明該病毒具有預(yù)防NDV 的作用。近年來(lái)，抗體藥物的研究和發(fā)展非常迅速[13-14]，在過(guò)去的30 年間，有30 多種免疫球蛋白及其衍生物作為抗體藥物用于癌癥、自身免疫病和傳染病等的診斷、預(yù)防及治療。同時(shí)，用于治療人類(lèi)各種疾病的抗體藥物已有報(bào)道[15-16]，然而重組抗體用于動(dòng)物病方面的研究還沒(méi)有報(bào)道。特別是具有本動(dòng)物源的治療性抗體在獸醫(yī)研究領(lǐng)域仍是空白，原因主要是制作成本高不便于應(yīng)用。為了克服這一難題，本研究選用DNV 作為載體結(jié)合基因工程抗體和反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)本動(dòng)物源抗體的病毒，由于NDV 易感于雞胚、便于應(yīng)用、且成本較低，克服了成本高所帶來(lái)的問(wèn)題。但是由于抗體分子量較大，為表達(dá)高水平量的抗體帶來(lái)了難題，為了克服這一難題，Carnero 等人證明，當(dāng)HIV gag 基因位于整個(gè)NDV 病毒基因組的不同轉(zhuǎn)錄位置時(shí)，P 和M 基因之間為HIV gag 基因的最佳插入位點(diǎn)[17]。張振宇等人證明通過(guò)IRES 攜帶外源基因的方式將RFP 基因分別插入到NDV 載體NP、P、M、F、HN 基因內(nèi)部時(shí)，IRES-RFP 位于NDV 載體NP 基因內(nèi)部作為第2 個(gè)閱讀框時(shí)RFP 表達(dá)量最高[18]。2019 年蘇明雪等人通過(guò)比較rNDV-EGFP（NP/P）、rNDVEGFP（P/M）、 rNDV-EGFP（M/F）和rNDV-EGFP（F/HN）的表達(dá)量，證明NP/P 位點(diǎn)是外源基因最佳插入位點(diǎn)[19]。然而NDV 表達(dá)抗體時(shí)，抗體插入位點(diǎn)的最佳方式尚不清楚。所以本研究進(jìn)行了不同的表達(dá)設(shè)計(jì)，構(gòu)建并拯救了5 種表達(dá)雞源IBDV 抗體的重組病毒，通過(guò)體內(nèi)和體外兩方面檢測(cè)了IBDV 雞源抗體的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)western blot 和ELISA 檢測(cè)結(jié)果證明抗體表達(dá)，體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明在免疫后的第3 d成功檢測(cè)到IBDV 抗體。為了進(jìn)一步探究病毒對(duì)于IBDV 的免疫效果，利用表達(dá)量高的重組病毒對(duì)人工感染IBDV（BC6/85 株）的SPF 雞進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明rNDV-L（NP/P）-H（P/M）、rNDV-H（P/M）和卵黃抗體免疫組法氏囊損傷程度明顯好于感染未預(yù)防組和NDV 免疫組，并對(duì)各組法氏囊損傷程度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示rNDV-H（P/M）組實(shí)驗(yàn)雞的保護(hù)率為75%，rNDV-L（NP/P）-H（P/M）組實(shí)驗(yàn)雞的保護(hù)率為50%，卵黃抗體組實(shí)驗(yàn)雞的保護(hù)率為62.5%，以上研究結(jié)果表明rNDV-H（P/M）、rNDV-L（NP/P）-H（P/M）和卵黃抗體均能有效減輕IBDV 對(duì)法氏囊淋巴濾泡的損傷作用，具有預(yù)防IBD 的效果，且rNDV-H（P/M）免疫組效果要好于rNDV-L（NP/P）-H（P/M）和卵黃抗體組。

本研究所獲得的重組病毒解決了卵黃抗體在使用過(guò)程中存在的一些弊端，如可能攜帶卵源傳染病病原，并且其含有較多的磷脂及脂肪，注射易引起機(jī)體不適，此外提取程序復(fù)雜成本較高。通過(guò)主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，成功解決了疫苗毒力強(qiáng)所帶來(lái)的問(wèn)題。如使用后會(huì)引起法氏囊組織損傷，導(dǎo)致免疫抑制，毒力返強(qiáng)和散毒等生物安全風(fēng)險(xiǎn)[20]。同時(shí)也解決了暫時(shí)沒(méi)有有效疫苗的傳染病如非洲豬瘟等[21]。通過(guò)病毒載體表達(dá)同源抗體，易于雞胚擴(kuò)大生產(chǎn)，工藝簡(jiǎn)單，成本較低，解決了獸醫(yī)領(lǐng)域由于成本高不能應(yīng)用治療性抗體的問(wèn)題。

綜上所述，NDV 載體表達(dá)的雞源重組抗體，具有成本低，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)這類(lèi)重組病毒能夠彌補(bǔ)卵黃抗體等的缺點(diǎn)，并且可以達(dá)到一針兩治的效果，具有很大的應(yīng)用前景，有望成為替代卵黃抗體預(yù)防和治療IBD 的本動(dòng)物源重組抗體生物制劑，同時(shí)也為基因工程抗體和病毒反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展提供了巨大的推動(dòng)力。