賈 月，華 欣，劉思國(guó)

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069；3. 東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

近10 年來(lái)，隨著臨床上抗生素使用頻率的逐年增加，不斷出現(xiàn)新的細(xì)菌抗性機(jī)制，導(dǎo)致各種耐藥細(xì)菌相繼出現(xiàn)，對(duì)人畜健康造成巨大損害。多粘菌素（Polymyxin B）是陽(yáng)離子多肽類(lèi)抗生素，帶正電荷的多粘菌素與帶負(fù)電荷的類(lèi)脂A結(jié)合，增加細(xì)胞膜的通透性，破壞革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是人類(lèi)抵抗革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”[1]。然而，一些細(xì)菌對(duì)多粘菌素逐漸產(chǎn)生耐藥性，研究證實(shí)由質(zhì)粒介導(dǎo)的多粘菌素耐藥基因mcr-1 可在不同地區(qū)、不同種屬之間通過(guò)接合型質(zhì)粒相互傳播[2]。MCR-1 蛋白的氨基酸序列與磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族高度相似，具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性，作用于類(lèi)脂A 的pNetN 部分；磷酸乙醇胺由R1 基團(tuán)和R2 基團(tuán)組成，在MCR-1 的催化下，R1 基團(tuán)的?；I斷裂轉(zhuǎn)移至類(lèi)脂A 的4 號(hào)位或1 號(hào)位上形成類(lèi)脂A 復(fù)合物，降低了類(lèi)脂A與多粘菌素的親和力[3-4]。因此，要延長(zhǎng)多粘菌素作為臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的使用期限，研發(fā)高效的MCR-1 抑制劑是最可行的方法。

綿馬酚（Aspidinol）是鱗毛蕨科植物的主要活性成分，在香鱗毛蕨中較為常見(jiàn)。香鱗毛蕨的主要活性成分為酚類(lèi)化合物，其中間苯三酚類(lèi)化合物最為常見(jiàn)，具有抗炎癥、抗菌、抗病毒等活性，對(duì)于治療真菌性疾病有良好的效果。綿馬酚為單環(huán)間苯三酚類(lèi)化合物，化學(xué)式為C12H16O4[5-7]。現(xiàn)在對(duì)于綿馬酚的研究還很少，但由于間苯三酚類(lèi)化合物具有的多種生理活性，國(guó)際上對(duì)綿馬酚的研究仍然十分關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)綿馬酚可以抑制MCR-1 蛋白活性，通過(guò)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)、殺菌效果測(cè)定、透射電鏡觀察菌體形態(tài)、質(zhì)譜檢測(cè)類(lèi)脂A 的結(jié)構(gòu)及Biacore 大分子互作驗(yàn)證綿馬酚與MCR-1 蛋白結(jié)合情況等實(shí)驗(yàn)確定了綿馬酚具有抑制MCR-1 蛋白的抗多粘菌素的耐藥特性，從而為開(kāi)發(fā)更多的MCR-1 蛋白抑制劑提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自BioFlux 公司，ExTaq、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa 公司，BamH Ⅰ、XhoⅠ、T4 連接酶購(gòu)自Thermo 公司； 24 株mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌，即JD01、JD02、 JD03、 JD04、 JD05、 JD06、 JD07、 JD08、JD09、JD010、JD11、JD012、ZD01、ZD02、ZD03、ZD04、ZD05、ZD06、ZD07、ZD08、ZD09、ZD10、ZD11 及ZD12，其中JD01～JD12 來(lái)源于黑龍江省某雞場(chǎng)，ZD01～ZD12 來(lái)源于黑龍江省某豬場(chǎng)，均由本實(shí)驗(yàn)室于2016 年分離并保存；參考株ATCC25922 為本實(shí)驗(yàn)室保存；pET-28a 載體、DH5α和BL21 感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa 公司；多粘菌素B、卡那霉素購(gòu)自Sigma-Aldrich，純度均為98%；綿馬酚為本實(shí)驗(yàn)室提取，純度為98%；LB 瓊脂培養(yǎng)基（LB Agar）、LB 肉湯培養(yǎng)基（LB Broth）購(gòu)自美國(guó)BD醫(yī)療器械有限公司。

1.2 主要儀器Biacore 大分子互作儀購(gòu)自美國(guó)GE公司，型號(hào)為Biacore T200；質(zhì)譜儀購(gòu)自SCIEX 公司，型號(hào)為T(mén)ripleTOF 6600。

1.3 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用棋盤(pán)微量稀釋法[8]測(cè)定綿馬酚（10 240 μg/mL）和多粘菌素（10 240 μg/mL）的最小抑菌濃度（MIC），然后依據(jù)CLSI 公布測(cè)定不同藥物組合對(duì)分離菌的抑制作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，在96 孔板中加入100 μL 稀釋后的藥物，使多粘菌素的濃度由上到下依次降低2 倍，綿馬酚的濃度由左到右依次降低2 倍，隨后分別加入24 株mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌分離株菌液100 μL（終濃度為5×105cfu/mL），37 ℃培養(yǎng)14 h～16 h，得出多粘菌素與綿馬酚聯(lián)合使用時(shí)各自的MIC，并根據(jù)綿馬酚及多粘菌素的MIC 值得到其FIC 指數(shù)[9]，F(xiàn)IC=（聯(lián)合時(shí)甲藥的MIC/甲藥的MIC）+（聯(lián)合時(shí)乙藥的MIC/乙藥的MIC），當(dāng)FIC<0.5為協(xié)同作用，即兩種藥物聯(lián)合后的藥效大于同樣濃度的兩種藥物抗菌作用的總和；0.52 為拮抗作用，即兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性小于單獨(dú)一種藥物的抗菌作用。

1.4 綿馬酚聯(lián)合多粘菌素使用時(shí)對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的殺菌效果的檢測(cè)根據(jù)1.3 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證綿馬酚聯(lián)合多粘菌素的殺菌效果，在2 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌JD08，37 ℃培養(yǎng)1 h，隨后向JD08菌株中分別加入終濃度為10 μg/mL的多黏菌素、終濃度為32 μg/mL 的綿馬酚和終濃度為10 μg/mL 的多黏菌素+32 μg/mL 的綿馬酚聯(lián)合作用各1管，置于37 ℃培養(yǎng)，分別于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 和12 h 各取100 μL 菌液加到LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，倒置37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。根據(jù)活菌數(shù)繪制時(shí)間-活菌數(shù)曲線，同時(shí)以正常培養(yǎng)的JD08 菌株為陰性對(duì)照，驗(yàn)證綿馬酚聯(lián)合多粘菌素使用時(shí)對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的殺菌效果。

1.5 透射電鏡觀察mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌菌體形態(tài)根據(jù)1.3及1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于經(jīng)過(guò)驗(yàn)證綿馬酚單獨(dú)使用對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌無(wú)效，因此選取聯(lián)合作用試驗(yàn)組進(jìn)一步試驗(yàn)。將mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌JD08 菌液培養(yǎng)至OD650nm0.6 時(shí)分成三份，每份2 mL，取出2 份分別轉(zhuǎn)接入含10 μg/mL 多粘菌素的LB 液體培養(yǎng)基中及含10 μg/mL 的多粘菌素+32 μg/mL 的綿馬酚的LB 液體培養(yǎng)基中，另外一份作為陽(yáng)性對(duì)照。將3 份菌液37 ℃培養(yǎng)4 h 后送哈爾濱獸醫(yī)研究所電鏡室進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.6 綿馬酚對(duì)MCR-1 蛋白的活性鑒定MCR-1 是一種磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，在磷酸乙醇胺存在的情況下，MCR-1 催化磷酸乙醇胺的?；I斷裂，生成類(lèi)脂A 復(fù)合物和甘油二酯。通過(guò)體外模擬MCR-1 催化磷酸乙醇胺反應(yīng)，可檢測(cè)綿馬酚對(duì)MCR-1 的蛋白活性。本試驗(yàn)采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法[10]分別提取mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌JD08 菌株和含有16 μg/mL 的綿馬酚的mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌JD08 菌株中類(lèi)脂A，利用質(zhì)譜儀檢測(cè)類(lèi)脂A 的結(jié)構(gòu)。

1.7 重組載體pET-28a-mcr-1 的表達(dá)與純化根據(jù)GenBank登錄的mcr-1基因序列（KP347127.1），使用primer premier 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物：F-5'-ATGGATC CAGTGCGCCAAAAGATACCATTT-3'/R-5'-GATCTCGA GTCAGCGGATGAATGCGGT-3'， 以JD08 菌 液 為 模板，PCR 擴(kuò)增mcr-1 基因，預(yù)計(jì)片段大小為987 bp。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃5 min、94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃1 min 40 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃7 min。PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收純化后，與pEF-28a 載體均用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR 鑒定及酶切鑒定后提取質(zhì)粒由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后離心和超聲破碎，上清經(jīng)鎳柱親和層析純化，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，觀察蛋白的表達(dá)，然后超濾濃縮即為重組蛋白MCR-1，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 MCR-1 蛋白與綿馬酚的Biacore 分子互作檢測(cè)使用pH 4.0 的醋酸鈉溶液將MCR-1 蛋白偶聯(lián)至CM5 芯片，將CM5 芯片裝進(jìn)儀器后用不同濃度（1.56 μmol/L、3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）的綿馬酚溶液置于質(zhì)譜儀中，按照操作程序進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)束后擬合MCR-1 蛋白與綿馬酚之間的結(jié)合情況。

2 結(jié) 果

2.1 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選取24 株mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)聯(lián)合用藥和單獨(dú)用藥試驗(yàn)，結(jié)果顯示，單獨(dú)使用綿馬酚時(shí)，mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌對(duì)綿馬酚均耐藥；單獨(dú)使用多粘菌素時(shí)，其MIC 值大多數(shù)為8 μg/mL（13 株），少數(shù)為4 μg/mL（7 株）和16 μg/mL（4 株）；綿馬酚與多粘菌素聯(lián)合作用時(shí)，多粘菌素的MIC 值均降低至1 μg/mL（14 株）或2 μg/mL（10 株）。本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合使用多粘菌素及綿馬酚的MIC 值比單獨(dú)使用多粘菌素時(shí)有著明顯的下降，其FIC 指數(shù)為0.07（2 株）、0.133（11 株）和0.258（7 株），均小于0.5，屬于協(xié)同作用，僅有4 株mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的FIC 指數(shù)為0.508，為相加作用（表1）。表明綿馬酚與多粘菌素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌產(chǎn)生了協(xié)同效果，抑菌效果明顯高于單獨(dú)使用多粘菌素或綿馬酚時(shí)的抑菌效果。同時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的MIC值為8 μg/mL， JD08 菌株最具代表性，因此選取JD08 菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 綿馬酚聯(lián)合多粘菌素使用時(shí)對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的殺菌效果的檢測(cè)結(jié)果向JD08 菌株中加入終濃度為10 μg/mL（10 倍MIC）的多黏菌素、終濃度為32 μg/mL（4 倍MIC）的綿馬酚和終濃度為10 μg/mL 的多黏菌素+終濃度為32 μg/mL 的綿馬酚聯(lián)合作用，活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，單獨(dú)使用32 μg/mL 綿馬酚對(duì)于mcr-1 陽(yáng)性的大腸桿菌JD08 無(wú)殺菌效果，其活菌量與正常培養(yǎng)的JD08 菌株相似；10 μg/mL 的多黏菌素對(duì)JD08 菌株幾乎無(wú)殺菌效果；32 μg/mL 的綿馬酚聯(lián)合10 μg/mL 的多黏菌素使用時(shí)對(duì)JD08 菌株有較好的殺菌效果，在8 h 時(shí)細(xì)菌基本死亡，未檢測(cè)到活菌（圖1）。表明聯(lián)合使用綿馬酚和多粘菌素對(duì)mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌有良好的殺菌效果。

2.3 透射電鏡觀察mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌菌體形態(tài)結(jié)果通過(guò)電鏡觀察正常培養(yǎng)的JD08菌株、10 μg/mL多粘菌素作用的JD08 菌株及10 μg/mL 多粘菌素+32 μg/mL綿馬酚的作用的JD08菌株，結(jié)果顯示mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌JD08 菌體形態(tài)較好，外膜完整，僅有輕微形變，可能是制作切片過(guò)程中的損傷（圖2A）；10 μg/mL的多粘菌素作用的JD08菌體內(nèi)容物少量流失，電子密度降低（圖2B）；10 μg/mL的多粘菌素及32 μg/mL的綿馬酚共同作用的JD08菌體形變明顯，內(nèi)容物流失嚴(yán)重，多數(shù)菌體只剩外膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)觀察到較多蛋白類(lèi)物質(zhì)，疑似菌體內(nèi)容物（圖2C）。表明聯(lián)合使用綿馬酚和多粘菌素對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌菌體的外膜產(chǎn)生了較大損傷，綿馬酚加劇了多粘菌素對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的損傷程度，這些損傷可造成細(xì)菌死亡。

表1 不同來(lái)源的mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的多粘菌素與綿馬酚聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)Table 1 MIC values of the polymyxin B and aspidinol combination therapy for different sources of mcr-1 positive E.coli

圖1 綿馬酚聯(lián)合多粘菌素對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的殺菌曲線Fig.1 Time-killing curves of polymyxin B combined aspidinol against mcr-1 positive E.coli

2.4 綿馬酚對(duì)MCR-1蛋白的活性檢測(cè)結(jié)果采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法提取類(lèi)脂A，如圖3A 所示，在mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌JD08 中分離出的類(lèi)脂大小為1 920.3 U，相比于未經(jīng)修飾的正常的類(lèi)脂A（1 797.1 U）增加了大約123 U。而如圖3B 所示，在綿馬酚存在的情況下，MCR-1蛋白的作用受到抑制，發(fā)生轉(zhuǎn)移的?；I含量大大減少。MCR-1蛋白具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的作用，與使用綿馬酚處理的JD08菌株中未修飾的類(lèi)脂A的比例相比，未使用綿馬酚處理的JD08菌株中經(jīng)過(guò)修飾的類(lèi)脂A的比例發(fā)生了顯著改變。表明綿馬酚影響了MCR-1蛋白發(fā)揮催化活性，使類(lèi)脂A形成了類(lèi)脂A 復(fù)合物，而綿馬酚有抑制MCR-1 蛋白的作用，使形成的類(lèi)脂A復(fù)合物大量減少。

圖2 透射電鏡觀察mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌JD08 形態(tài)Fig.2 The morphology of mcr-1 positive E.coli JD08 under transmission electron microscope

圖3 質(zhì)譜檢測(cè)JD08 菌株中類(lèi)脂A 的變化情況Fig.3 Detection of Lipid A in JD08 strain by Mass spectrometry

2.5 MCR-1 蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果將經(jīng)過(guò)雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序正確的pET-28a-mcr-1 重組載體經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后表達(dá)MCR-1 蛋白，上清通過(guò)鎳樹(shù)脂純化后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果顯示在38 ku 處有目的蛋白表達(dá)，與預(yù)期一致，表明正確構(gòu)建了pET-28a-mcr-1 重組載體（圖4），并且MCR-1 蛋白在上清表達(dá)。對(duì)表達(dá)上清純化后經(jīng)CA 定量試劑盒測(cè)得蛋白質(zhì)濃度為11.17 mg/mL（圖5）。

2.6 MCR-1 蛋白與綿馬酚的Biacore 分子互作檢測(cè)通過(guò)不同濃度的綿馬酚與偶聯(lián)至CM5 芯片上的MCR-1 蛋白相互作用，檢測(cè)MCR-1 蛋白與綿馬酚的親和力，Biacore 分析結(jié)果顯示，綿馬酚與MCR-1 蛋白相互作用響應(yīng)值隨綿馬酚濃度增高不斷增強(qiáng)，根據(jù)擬合結(jié)果分析顯示，MCR-1蛋白與其小分子抑制劑的親和力常數(shù)為1.47 μmol/L（圖6）。表明兩者之間存在直接結(jié)合，綿馬酚屬于MCR-1蛋白的小分子抑制劑。

圖4 重組載體pET-28a-mcr-1 酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 The digestion rusult of recombinant vector pET-28a-mcr-1

圖5 重組蛋白MCR-1 的SDS-PAGE 檢測(cè)Fig.5 Detection of purified MCR-1 recombinant protein by SDS-PAGE

圖6 Biacore 測(cè)定綿馬酚與MCR-1 蛋白之間相互作用力Fig.6 The interaction between Mianmatol and MCR-1 protein by Biacore

3 討 論

mcr-1 是2015 年首次被報(bào)道的由質(zhì)粒介導(dǎo)的多粘菌素耐藥基因[1]，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)已在30 多個(gè)國(guó)家檢出，這表明mcr-1 基因已在全球范圍內(nèi)存在，在我國(guó)已有25 個(gè)省/自治區(qū)分離到了攜帶有mcr-1 基因的細(xì)菌[11]。同時(shí)，在動(dòng)物源性食品和醫(yī)院感染病人樣品中也分離出了攜帶有mcr-1 基因的細(xì)菌。氨基酸序列分析結(jié)果顯示MCR-1 蛋白與已報(bào)道的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族約有60%的相似性，即MCR-1 蛋白可能具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性[1]。Zhou 等研究了紫檀芪和多粘菌素對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌產(chǎn)生了協(xié)同效果，其MIC 值由8 μg/mL 降低到1 μg/mL[11]。Lan 等通過(guò)虛擬篩選確定了1-苯基-2-（苯胺基）乙酮屬于MCR-1 抑制劑，并對(duì)此設(shè)計(jì)了1-苯基-2-（苯胺基）乙酮的衍生物。通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)其中兩種衍生物6p和6q 可以通過(guò)氫鍵與Glu246和Thr285相互作用，并占據(jù)MCR-1 蛋白的空腔[12]。Zhou 等證實(shí)蛇床子素可恢復(fù)多粘菌素對(duì)mcr-1 陽(yáng)性腸桿菌的抑菌活性[13]。

本實(shí)驗(yàn)基于對(duì)mcr-1 基因的基礎(chǔ)研究上篩選和鑒定了MCR-1 蛋白的小分子抑制劑-綿馬酚，通過(guò)聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了綿馬酚與多粘菌素聯(lián)合可顯著增強(qiáng)對(duì)mcr-1 陽(yáng)性大腸桿菌的抑菌效果，其MIC 值由8 μg/mL 或16 μg/mL 降 低 到1 μg/mL 或2 μg/mL，殺菌實(shí)驗(yàn)和透射電鏡觀察均表明單獨(dú)使用多粘菌素或綿馬酚均無(wú)法完全殺滅細(xì)菌，但聯(lián)合使用時(shí)具有顯著的殺菌效果。進(jìn)一步證明綿馬酚能夠增加多粘菌素的殺菌效果，而多粘菌素是作用在類(lèi)脂A 上發(fā)揮作用，MCR-1 為磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，同樣作用于類(lèi)脂A 上，從質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)綿馬酚處理的未經(jīng)修飾的類(lèi)脂A 含量相比經(jīng)過(guò)修飾的類(lèi)脂A 含量多。Biacore 大分子互作結(jié)果也可以看出綿馬酚于MCR-1 蛋白屬于直接結(jié)合，因此綿馬酚很大可能是MCR-1 的小分子抑制劑。推測(cè)可能是由于綿馬酚能夠與MCR-1 蛋白的催化區(qū)域中的某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，使MCR-1 蛋白失活，無(wú)法生成類(lèi)脂A 復(fù)合物，恢復(fù)了多粘菌素的功效，破壞革蘭氏陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)菌死亡。Stojanoski[14]、Hinchliffe[15]、Wei[16]、Xu[17]和Ma[18]等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了E246A、T285A、K333A、H395A、H466A、H478A 等突變體恢復(fù)了多粘菌素對(duì)mcr-1 陽(yáng)性菌的敏感性，本研究團(tuán)隊(duì)將會(huì)針對(duì)以上涉及到的幾種重要的突變位點(diǎn)進(jìn)行中重點(diǎn)研究，以明確多粘菌素耐藥關(guān)鍵蛋白MCR-1 的小分子抑制劑的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)MCR-1 抑制劑提供幫助。