羅 丹，高 立，孟照潔，高玉龍，李 凱，祁小樂(lè)，劉長(zhǎng)軍，崔紅玉，王笑梅,3*

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069；2. 山東和康源生物育種股份有限公司，山東 濟(jì)南 271018；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）病是一種以肝脾不規(guī)則壞死、出血斑/點(diǎn)和心肌、腔上囊出血為主要特征的疫病，其發(fā)病率和病死率差異較大，且患病鴨日齡愈小，發(fā)病率、病死率愈高[1-2]。2005 年冬季以來(lái)，該病在福建、廣東、浙江、安徽等番鴨、半番鴨、北京鴨、麻鴨養(yǎng)殖地相繼暴發(fā)[3-5]。NDRV 感染后可引起患鴨免疫器官萎縮或壞死等病變，成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要免疫抑制性疾病。近年來(lái)，NDRV 病發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病范圍逐漸擴(kuò)張，感染宿主譜變廣，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。

2006 年劉紅等首次從北京鴨壞死脾病料中分離到一株NDRV[3]，隨后，陸續(xù)從番鴨、北京鴨、鵝等水禽中分離到多株NDRV[4-7]。本研究于2019 年從山東省某養(yǎng)鴨企業(yè)25 份櫻桃谷鴨臟器組織中分離出3株NDRV，將該3 株病毒與2016 年～2017 年分離的2株NDRV 進(jìn)行生物學(xué)特性的比較，并分析其σC 基因同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系，以探究該企業(yè)不同年份分離病毒的生物學(xué)特性差異，以期為鴨呼腸孤病的流行病學(xué)調(diào)查積累資料，并為防控該病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品、病毒和雞胚25 份病料樣品來(lái)自山東某養(yǎng)鴨企業(yè)，其中關(guān)節(jié)組織12 份，肝臟組織8 份，脾臟組織4 份，關(guān)節(jié)膿液1 份，按送檢順序分別將病料命名為arthrosis/duck/SD19/6301-6308、arthrosis/duck/SD19/7301-7304、liver/duck/SD19/6203-6206、liver/duck/SD19/7301-7304、spleen/duck/SD19/7301-7304、pus/duck/SD19/7304。感染鴨后期出現(xiàn)瘸腿、站立不穩(wěn)、肌腱斷裂等癥狀，病理剖檢顯示部分鴨出現(xiàn)明顯的脾壞死。 細(xì)胞培養(yǎng)病毒液1 份，為2016 年從該養(yǎng)鴨企業(yè)鴨的壞死脾臟組織中分離的病毒；鴨胚尿囊液1 份，為2017 年從該養(yǎng)鴨企業(yè)的鴨壞死脾臟組織中分離的病毒；上述兩份病原未被確定是否為NDRV。SPF 雞胚由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑pMD18-T 載體、TRIzol 試劑、E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker、Premix Taq預(yù)混酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；核酸凝膠回收試劑盒、病毒DNA/RNA 提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自Axy Prep 公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase 購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 病料樣品處理取適量病料組織，加入1 mL滅菌PBS 研磨，得到混懸液，反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min（4 ℃）離心5 min，取上清液，用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病料樣品的RT-PCR 鑒定根據(jù)GenBank 中登錄的NDRV S1 基因參考序列（KJ879930），選取其保守區(qū)域設(shè)計(jì)NDRV 的特異性檢測(cè)引物，上游引物：5'-GTTGAGACGCCTGACTAC-3'/下游引物：5'-GGAT?GCTTGGAGTGAGAC-3'，由吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成。取1.3 病料樣品研磨液各200 μL，用TRIzol試劑提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書。

以上述cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為373 bp。鑒定為陽(yáng)性的病料樣品將進(jìn)行后續(xù)的病毒分離。

1.5 病毒的分離培養(yǎng)與傳代將上述鑒定為陽(yáng)性的病料樣品濾液及2016 年分離病毒細(xì)胞培養(yǎng)液和2017年分離病毒鴨胚尿囊液分別經(jīng)卵黃囊接種4 枚7 日齡的SPF 雞胚，0.1 mL/枚，置于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置正常雞胚對(duì)照。逐日觀察雞胚的存活情況，收獲死亡雞胚的尿囊用于下一代雞胚接種，依次連續(xù)盲傳3 代，將每代收獲的尿囊液經(jīng)1.4 的PCR 鑒定為陽(yáng)性后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 分離病毒的外源病毒檢測(cè)分別采用TRIzol 法和核酸提取試劑盒提取1.5 獲得的5 株分離病毒的F3代尿囊液的RNA 及DNA，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cD?NA。以提取的DNA 或cDNA 為模板，利用1.4 中設(shè)計(jì)的NDRV 特異性引物和鴨瘟病毒（DPV）引物[8]、禽流感病毒（AIV）M 基因檢測(cè)引物（農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NYT772-2013》）、鴨肝炎病毒（DHV）檢測(cè)引物[9]、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）檢測(cè)引物[10]、鴨細(xì)小病毒（GPV）檢測(cè)引物[11]、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）檢測(cè)引物[12]分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)分離病毒的外源病毒。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)將18 只1 日齡雛鴨隨機(jī)分成6組，每組3 只，其中5 組分別感染NDRV 分離病毒，1組為空白對(duì)照組。將上述分離病毒的F3 代雞胚尿囊液均經(jīng)腿部肌肉注射感染雛鴨，0.1 mL/羽，對(duì)照組注射等量PBS。采用隔離器飼養(yǎng)，保證充足的飲水、采食和光照，定時(shí)觀察并記錄雛鴨發(fā)病狀況，觀察期為14 d。接種后第14 d，頸靜脈放血迫殺所有雛鴨，剖檢并觀察其肝臟和脾臟的病理變化。同時(shí)采集其肝、脾組織，經(jīng)研磨無(wú)菌處理后接種7 日齡SPF 雞胚，再次進(jìn)行病毒分離，取其F3代的培養(yǎng)液經(jīng)1.4的RT-PCR鑒定，PCR產(chǎn)物由吉林庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

1.8 分離病毒的體外細(xì)胞培養(yǎng)特性將上述1.5 中獲得的5株分離病毒的F3代尿囊液分別接種原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）及傳代Vero細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)5 d ～7 d，同時(shí)分別設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)5代，觀察每代病毒增殖產(chǎn)生的細(xì)胞病變（CPE）情況。

1.9 分離病毒σC 基因的PCR 擴(kuò)增、同源性及遺傳進(jìn)化分析根據(jù)GenBank 登錄的NDRV σC 基因序列（KF729982）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物σCF：5'-ATG?GATCGCAACGAGGTGATA-3'/σCR： 5'-CTAGCCCGT?GGCGACGGTGAA'，利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)獲得的5 株分離病毒分別進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為966 bp。利用生物信息學(xué)軟件DNAStar、Mega6.0 及在線 軟 件Multalin（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）分析5 株分離病毒之間及其與GenBank登錄的NDRV、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）及禽呼腸孤病毒（ARV）代表株的σC 基因及其編碼的氨基酸序列的同源性；利用Mega 6.0 軟件構(gòu)建分離病毒的σC 基因的進(jìn)化樹(shù)，并分析其與上述NDRV、MDRV、ARV的遺傳進(jìn)化關(guān)系。ARV138 株（Chicken/1998，Canada）、S1133 株（Chicken/1974，USA）為ARV 的參考株；MS01株（Chicken/2015，China）為本實(shí)驗(yàn)室分離的ARV[13]。

2 結(jié) 果

2.1 病料樣品的RT-PCR 鑒定結(jié)果以25 份病料樣品的cDNA 為模板，利用1.4 的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，病料樣品arthrosis/duck/SD19/6304、arthrosis/duck/SD19/6307、pus/duck/SD19/7304 均 可 擴(kuò)增到一條370 bp 左右的目的條帶，與預(yù)期大小一致，表明上述3份病料樣品可能存在NDRV的感染。

2.2 病毒的分離及傳代將上述經(jīng)RT-PCR 鑒定為NDRV 陽(yáng)性的3 份組織混懸液過(guò)濾除菌，并與2016年、2017 年的分離病毒分別經(jīng)卵黃囊接種7 日齡雞胚。結(jié)果顯示，接種雞胚均在36 h～60 h 內(nèi)死亡，致死率100%。死亡胚胎蜷縮、出血，胚體水腫，個(gè)別胚體甚至形成淤血斑。對(duì)照雞胚生長(zhǎng)良好，無(wú)任何上述癥狀出現(xiàn)。將上述死亡雞胚尿囊液連續(xù)傳代3 次，收獲其尿囊液經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后備用。

2.3 分離病毒的外源病毒檢測(cè)將2.2 收獲的5 株分離病毒的F3 代尿囊液分別經(jīng)AIV、DHV、DT?MUV、GPV、MDRV、NDRV 的PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示5 株分離株僅NDRV 檢測(cè)為陽(yáng)性，其它病毒檢測(cè)均為陰性，表明分離病毒均純凈性良好。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果5 株NDRV 分離病毒的F3代雞胚尿囊液感染雛鴨后，在整個(gè)觀察期內(nèi)均僅有個(gè)別雛鴨出現(xiàn)喜臥，精神沉郁，食欲減退，總體發(fā)病癥狀不明顯，無(wú)雛鴨死亡現(xiàn)象。感染后第14 d，剖殺所有雛鴨，剖檢顯示脾臟明顯腫大，呈暗紅色，并伴有不同程度的壞死。取肝臟和脾臟研磨后經(jīng)卵黃囊途徑接種7 日齡SPF 雞胚，接種雞胚均在36 h～60 h 內(nèi)死亡，且100%致死雞胚，死亡胚胎蜷縮、出血，胚體水腫等，與病毒初次分離接種雞胚時(shí)的癥狀一致，而對(duì)照雞胚生長(zhǎng)良好，無(wú)任何上述癥 狀 出 現(xiàn)。其F3 代 的 培 養(yǎng) 液 經(jīng)1.4 的RT-PCR 鑒 定結(jié)果均為陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的基因均為NDRV S1 基因片段序列，以上結(jié)果表明5 株NDRV分離病毒的動(dòng)物回歸試驗(yàn)成立。將2019年分離獲得的3 株NDRV，分別命名為NDRV-SD19/6304、NDRVSD19/6307 和NDRV-SD19/7304；將2016 年、2017 年分離的2 株NDRV 分別命名為NDRV-SD19/6201 和NDRV-SD19/6202。

2.5 分離病毒的體外細(xì)胞培養(yǎng)特性分別將5 株NDRV 分離病毒接種原代CEF 及傳代Vero 細(xì)胞，觀察其CPE。結(jié)果顯示，NDRV-SD19/6304、NDRVSD19/6307、NDRV-SD19/7304 及NDRV-SD19/6201 株病毒在兩種細(xì)胞中均可增殖，產(chǎn)生明顯CPE（圖1）。而NDRV-SD19/6202 株僅在Vero 細(xì)胞中增殖產(chǎn)生明顯CPE（圖1A），其在CEF 中連續(xù)盲傳至5 代仍觀察不到明顯CPE。而其余分離病毒均在CEF中產(chǎn)生典型的CPE：接種病毒48 h 后細(xì)胞融合聚集成簇，形成合胞體，部分細(xì)胞脫落；72 h 后，80%細(xì)胞死亡、脫落，貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯減少。以上結(jié)果表明，2017年的分離病毒與2016 年及新分離的3 株病毒在體外細(xì)胞中的生長(zhǎng)特性存在較明顯差異。

圖1 NDRV 分離病毒體外感染細(xì)胞后的CPE 觀察Fig.1 The observation of cytopathy induced by NDRV isolates

2.6 分離病毒σC 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果利用本研究設(shè)計(jì)合成的NDRV σC基因的特異性引物，對(duì)上述5 株分離病毒進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示均可獲得約1 000 bp的目的條帶，與預(yù)期一致（圖2）。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，分離的5株病毒均為NDRV。

圖2 5 株分離病毒的σC 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of σC gene of five NDRV isolates by RT-PCR

2.7 分離病毒σC 基因同源性及遺傳進(jìn)化分析利用DNAStar 軟件，對(duì)5 株分離病毒σC 基因的核苷酸及編碼的氨基酸序列分別進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示NDRV-SD19/6202 株與其余4 株分離病毒的核苷酸序列同源性為95.7%～95.8%，氨基酸序列同源性為95.7%～96.0%。5 株分離病毒與其他NDRV 分離株相應(yīng)基因核苷酸序列同源性為90.0%～98.2%，與MDRV分離株相應(yīng)基因核苷酸序列同源性為29.6%～46.1%。利用Mega 6.0 軟件，將5 株分離病毒與其他NDRV、MDRV 及ARV 代表株的σC 基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，所有病毒株分為明顯的2 個(gè)分支即雞源分支和水禽源分支，而水禽源分支又分為經(jīng)典MDRV 分支和NDRV 分支，本研究中5 株分離病毒均位于NDRV 分支，其中NDRV-SD19/6201、NDRVSD19/6304、NDRV-SD19/6307、NDRV-SD19/7304 遺傳距離較近，處于同一小分支，而NDRV-SD19/6202與2013 年分離株HN5d-KT861593 處于同一分支，遺傳關(guān)系較近（圖3）。上述結(jié)果表明，源于同一養(yǎng)殖企業(yè)不同時(shí)間分離的NDRV，其主要保護(hù)性抗原σC 蛋白的基因序列存在的較大差異，提示該地區(qū)NDRV 隨著時(shí)間的推移發(fā)生了變異。

利用Multalin 在線軟件對(duì)在CEF 中復(fù)制特性不同的兩株分離病毒NDRV-SD19/6201 與NDRV-SD19/6202 的σC 基因編碼氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示兩者之間存在13 個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，分別位于第P9L、Y16C、T25K、I64T、E65D、L66M、G74S、L87V、T91L、A132S、V298A、I306T、R310Q位（圖4）。以上結(jié)果表明，以NDRV-SD19/6201 為代表的CEF 適應(yīng)株與CEF非適應(yīng)株NDRV-SD19/6202 之間，在σC 基因核苷酸及其編碼的氨基酸水平上均存在一定的遺傳距離及差異，但該差異位點(diǎn)是否是造成兩株分離病毒復(fù)制特性差異的關(guān)鍵位點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究。

圖3 NDRV 分離株的σC 基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on the σC nucleotide sequences of NDRV isolates

3 討 論

本研究于2019 年從山東省某養(yǎng)鴨企業(yè)送檢的25份櫻桃谷鴨臟器組織中分離到3 株NDRV，將其與2016 年、2017 年分離的NDRV 一起進(jìn)行生物學(xué)特性比較研究。結(jié)果顯示5 株分離病毒均能100%致死雞胚，導(dǎo)致死亡雞胚水腫、全身出血，甚至形成淤血斑。人工感染1 日齡雛鴨均能復(fù)制出與臨床自然發(fā)病鴨相同的臨床癥狀和病理變化，并能從感染雛鴨組織中再次分離到該病毒。病毒體外培養(yǎng)特性研究表明，5 株分離病毒均能在Vero 細(xì)胞中增殖，產(chǎn)生明顯的CPE；但在CEF 中的生長(zhǎng)特性存在明顯差異：2017 年分離的NDRV-SD19/6202 株在CEF 中連續(xù)盲傳5 代也不能產(chǎn)生明顯CPE，表明該株病毒不能在CEF 中良好增殖，而其余4 株分離病毒均能在CEF 中產(chǎn)生典型的CPE，造成此差異的具體原因有待進(jìn)一步研究。

病毒σC 蛋白是由NDRV 的S1 基因編碼，全長(zhǎng)321 個(gè)氨基酸，是構(gòu)成病毒粒子外層衣殼的主要蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[14]；另一方面，σC 蛋白作為病毒結(jié)合細(xì)胞受體的主要位點(diǎn)，對(duì)病毒的吸附、增殖和合胞體的形成起重要作用，并能促進(jìn)病毒的侵襲[15]。為了研究分離病毒與其他禽類呼腸孤病毒的遺傳關(guān)系，本研究克隆了該蛋白基因，并對(duì)其進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，NDRV-SD19/6202株與其余4 株分離病毒的遺傳距離較遠(yuǎn)，與其核苷酸序列同源性為95.7%～95.8%，氨基酸序列同源性為95.7%～96.0%。遺傳進(jìn)化分析顯示，5株分離病毒均位于NDRV 分支，其中NDRV-SD19/6201、6304、6307、7304 遺傳距離較近，位于同一小分支內(nèi)，與NDRVSD19/6202 遺傳距離較遠(yuǎn)；NDRV-SD19/6202 與NDRV分離株HN5d-KT861593 處于同一進(jìn)化分支，二者親緣關(guān)系較近。HN5d 株病毒為鄭獻(xiàn)進(jìn)等于2013 年從北京鴨分離的一株具有高致病性的NDRV[16]，其在Vero細(xì)胞中也具有良好的復(fù)制能力且產(chǎn)生明顯的CPE，但對(duì)其是否能在CEF中復(fù)制并產(chǎn)生CPE并沒(méi)有報(bào)道。遺傳距離的差異可能是造成NDRV-SD19/6202 株與其余4 株分離病毒在CEF 中產(chǎn)生復(fù)制差異的一個(gè)原因。以上結(jié)果表明，源于同一養(yǎng)殖企業(yè)不同時(shí)間分離的NDRV 病毒株在其主要保護(hù)性抗原σC 蛋白的基因序列呈現(xiàn)多樣性，提示該地區(qū)NDRV 隨著時(shí)間的推移在不斷發(fā)生著變異，但該5 株分離病毒σC 蛋白基因的遺傳進(jìn)化與其分離時(shí)間無(wú)明顯密切相關(guān)性。

為進(jìn)一步探究造成上述分離株在CEF 中復(fù)制差異產(chǎn)生的原因，本研究選取NDRV-SD19/6201 作為適應(yīng)CEF 增殖的代表株，與非適應(yīng)CEF 增殖的NDRV-SD19/6202 株的σC 蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示兩株病毒之間共存在13 個(gè)差異位點(diǎn)。有研究報(bào)道顯示，σC C 端的aa151～aa326 位點(diǎn)為呼腸孤病毒的受體結(jié)合區(qū)域[17]，上述差異位點(diǎn)中第298、306 及310 位氨基酸位點(diǎn)均位于該區(qū)域內(nèi)，該3 處位點(diǎn)或其它位點(diǎn)的差異是否是造成NDRV-SD19/6202 株與其余4 株分離病毒在CEF 中復(fù)制產(chǎn)生的差異還需要進(jìn)一步研究。

圖4 兩株NDRV 分離病毒σC 基因編碼氨基酸序列的比對(duì)分析Fig.4 Analysis of σC amino acid sequences of two NDRV isolates

綜上，本研究對(duì)從同一養(yǎng)鴨企業(yè)2016 年～2019年分離獲得的5 株病毒進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明5株分離病毒均位于NDRV 分支，但它們之間的復(fù)制特性存在明顯的差異，其誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體產(chǎn)生的σC 蛋白氨基酸序列之間存在多個(gè)差異位點(diǎn)，提示NDRV 存在不斷的遺傳變異，應(yīng)持續(xù)開(kāi)展該病的流行病學(xué)調(diào)查以深入了解NDRV 的遺傳進(jìn)化特征和基因變異情況，為有效防控NDRV 感染的疾病提供參考。