羅 毅，符 芳，李 亮，尹靈丹，郭珊珊，薛 美，孫 元，單玲玲，李 忍，劉 翔，馮 力，劉平黃

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬消化道傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可引發(fā)豬的腹瀉、脫水、嘔吐，對7日齡的仔豬致死率接近100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害[1]。我國在2010 年出現(xiàn)PEDV 變異株后，引起了PED 大規(guī)模暴發(fā)，并迅速流行。盡管市場上有PEDV 的滅活苗和弱毒苗，但大部分疫苗都是用于接種母豬，以提高其血清與乳汁中的抗體水平，進(jìn)而對仔豬產(chǎn)生被動免疫保護(hù)作用，但由于疫苗廣譜性不夠且保護(hù)效果與母豬泌乳量密切關(guān)聯(lián)，有時(shí)免疫保護(hù)效果并不理想，時(shí)常有PED疫情的暴發(fā)[2]。因此，開發(fā)研究針對該病的新的治療性制劑很有必要。有研究表明，變異株主要在PEDV 的S 基因區(qū)產(chǎn)生突變[3]。而本實(shí)驗(yàn)室之前通過B 細(xì)胞PCR 技術(shù)分離到一株P(guān)EDV 廣譜中和抗體PC10-IgG，其被證明可靶向結(jié)合PEDV S 蛋白的構(gòu)象表位，能特異性的結(jié)合基因Ⅰ型和Ⅱ型PEDV，并有效抑制兩種基因型的PEDV 感染，因此其具有開發(fā)成治療性抗體的潛能[4]。

腺病毒是目前應(yīng)用較為廣泛的基因治療載體之一，它是一種非整合性雙鏈DNA 病毒，在自然界中廣泛分布。腺病毒作為載體具有易于制備、純化和濃縮；獲得的病毒滴度高；能穩(wěn)定表達(dá)外源基因，卻不能將其整合到宿主基因等優(yōu)點(diǎn)[5]。而人5 型復(fù)制性缺陷型腺病毒（Ad5）就是其中發(fā)展較為成熟的一種腺病毒載體用于人或動物疫苗的研制[6]；此外，該載體還被用于表達(dá)干擾素，后者在動物體內(nèi)呈現(xiàn)良好的抗病毒效果[7]。有研究表明Ad5 能夠感染豬的小腸并表達(dá)目的蛋白，表達(dá)的目的蛋白在感染后的48 h～72 h 出現(xiàn)高峰期[8]?；诖?，本研究通過構(gòu)建表達(dá)PC10-IgG 的重組腺病毒Ad5-PC10-IgG，對其在體外和小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平和抗病毒效果進(jìn)行初步探究，以期為防治PED 提供一種新型的潛在治療制劑。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料HEK293 細(xì)胞、Vero E6 細(xì)胞、PEDV CV777 株、豬小腸類器官腸小體、PEDV 高免豬血清241、鼠源抗PEDV N 蛋白單克隆抗體（MAb）[9]由本實(shí)驗(yàn)室保存；Lipofectmine 3000 購自Invitrogen 公司；DMEM、DMEM/F12 培養(yǎng)基和胎牛血清均購自GIBCO 公 司；Kpn I、Xho I、Pme I、Pac I 內(nèi) 切 酶 以及T4 連接酶均購自NEB 公司；大腸桿菌BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞購自Genmed 公司；大腸桿菌XL10-GOLD感受態(tài)細(xì)胞購自唯地生物科技有限公司；樹脂Protein A 購自美國Abbkin 公司；鼠抗豬IgG-FITC 購自Bioscience 公司；羊抗豬IgG-HRP 和羊抗豬IgG H&L-FITC 均購自Abcom 公司；羊抗豬IgG（FC）抗體購自Bio-RAD 公司；羊抗鼠-FITC 抗體購自Thermo公司；DyLight 700 抗羊抗體購自北京中杉金橋生物公司；DAPI 購自Sigma 公司；SYBRTMGreen 熒光定量試劑盒購自Invitrogen 公司；TMB 購自Amiresco 公司；Pshuttle-CMV 質(zhì)粒以及AdEasyTM質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所孫元老師惠贈。

1.2 重組腺病毒質(zhì)粒pad5-PC10-IgG 的構(gòu)建與鑒定在PC10-IgG全長基因序列中插入furin蛋白酶切割位點(diǎn)和2A 元件[10]，并在PC10-IgG 5'端設(shè)計(jì)Kpn I 酶 切位點(diǎn)，在3'端設(shè)計(jì)Xho I 酶切位點(diǎn)后，由北京六合華大基因科技有限公司制成穿刺菌菌種，涂板，提取質(zhì)粒。利用Kpn I/Xho I 雙酶切該質(zhì)粒獲得的PC10-IgG 基因片段克隆到pshuttle-CMV 穿梭載體中，構(gòu)建重組穿梭載體pshuttlePC10-IgG。Kpn I 和Xho I 雙酶切并測序鑒定正確后將pshuttlePC10-IgG 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至Ad5 骨架質(zhì)粒AdEasyTM 中經(jīng)同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pad5-PC10-IgG 并通過Pac I 單酶切鑒定。按同樣的方法將pshuttle-CMV 與Ad5 骨架質(zhì)粒同源重組構(gòu)建腺病毒空載體pAd5。

1.3 重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 的構(gòu)建與鑒定待6 孔板中的HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%密度時(shí)進(jìn)行下述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：將4 μg pad5-PC10-IgG 與pAd5利用Pac I 酶切，將二者分別與LIP3000 試劑混合后轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h 后將培養(yǎng)液換成含有3%FBS 的培養(yǎng)液。于37 ℃5%CO2培養(yǎng)10 d～12 d直至出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）后，反復(fù)凍融離心收獲上清，以該培養(yǎng)上清為一抗，羊抗豬IgG-HRP（1:80 000）為二抗，采用間接ELISA 方法檢測，結(jié)果為陽性的即為重組腺病毒Ad5-PC10-IgG，將其接種HEK293 細(xì)胞，待出現(xiàn)CPE 后繼續(xù)傳至第4代，采用殼蛋白免疫法測定該重組病毒的效價(jià)為108pfu/mL[11]。將Ad5-PC10-IgG 按MOI 5 的劑量接種密度為2×107個(gè)/mL 的HEK293 懸浮細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)生50%的CPE后收獲細(xì)胞及上清。離心后按上述方法測定Ad5-PC10-IgG 的效價(jià)為1×1011pfu/mL，用于后續(xù)小鼠試驗(yàn)。

1.4 Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 細(xì)胞后PC10-IgG 表達(dá)的鑒定將1.3 獲 得 的Ad5-PC10-IgG 以MOI 5感染HEK293細(xì)胞，48 h收獲上清經(jīng)樹脂protein A 純化后，采用SDS-PAGE 鑒定上清中的PC10-IgG，同時(shí)將241血清經(jīng)樹脂protein A純化獲得的IgG和Ad5感染的293細(xì)胞上清分別作為陽性、陰性對照。以羊抗豬IgG（FC）（1:5 000）為一抗，DyLight 700 抗羊抗體（1:10 000）為二抗，通過western blot 進(jìn)一步鑒定。

1.5 PC10-IgG 表達(dá)量的測定將Ad5-PC10-IgG 以MOI 2 感染HEK293 細(xì)胞，分別收獲感染后48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 和108 h 細(xì)胞培養(yǎng)上清，以該培養(yǎng)上清為一抗，羊抗豬IgG-HRP（1:80 000）為二抗，采用間接ELISA 方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中PC10-IgG 的表達(dá)量。同時(shí)將241 血清和Ad5 感染293細(xì)胞的上清分別作為陽性、陰性對照。

1.6 PC10-IgG 對PEDV 結(jié)合活性的檢測將PEDV 病毒液稀釋至4 000 TCID50后接種96 孔板中處于對數(shù)生長期的Vero E6 細(xì)胞，37 ℃孵育2 h 后，加入3%FBS 的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。感染36 h 后用多聚甲醛固定細(xì)胞，Triton X-100 打孔后用含5%的脫脂乳和5%胎牛血清的PBS 封閉2 h 后，以Ad5-PC10-IgG感染的HEK293 細(xì)胞上清為一抗，羊抗豬IgG H&L-FITC（1:800）為二抗， DAPI（1:100）染細(xì)胞核，同時(shí)設(shè)241 血清為陽性對照，Ad5 感染的HEK293 細(xì)胞上清、正常Vero E6 細(xì)胞為陰性對照以及加相同體積封閉液的PEDV 對照。經(jīng)IFA 檢測PC10-IgG 對PEDV 結(jié) 合 活 性。

1.7 PC10-IgG對PEDV抑制活性的檢測取100 μL感染Ad5-PC10-IgG的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清與100 μL PEDV CV777 株（4 000 TCID50/mL，含3 μL/mL 0.25%胰酶，1%sp）混合，37 ℃孵育1 h 后加入到96 孔板中生長良好的Vero E6 細(xì)胞中，37 ℃孵育2 h 后，加入3%FBS 的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。36 h 后，分別收取細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞。提取培養(yǎng)上清中的RNA 并反轉(zhuǎn)錄cDNA 后作為模板，以F：5'-GCACTTATTGGCAG?GCTTTGTR-3'/R：5-CCATTGAGAAAAGAAAGTGTCG?TAG-3'為引物，利用SYBRTMGreen I 熒光定量PCR 檢測PEDV 的載量；同時(shí)以鼠源抗PEDV N 蛋白MAb（1:100）為一抗，羊抗鼠FITC-IgG（1:500）為二抗，DAPI（1:100）染 細(xì) 胞 核， IFA 檢 測PC10-IgG 對PEDV 的抑制活性，同時(shí)設(shè)241 血清為陽性對照，Ad5 感染的HEK293 細(xì)胞上清、正常Vero E6 細(xì)胞為陰性對照以及PEDV 對照。

1.8 Ad5-PC10-IgG 感染豬小腸類器官模型腸小體試驗(yàn)將回腸小體[12]在96 孔板培養(yǎng)至90%左右，以MOI 10 的劑量接種重組腺病毒Ad5-PC10-IgG，同時(shí)設(shè)Ad5 感染的回腸小體以及正常的回腸小體為對照。37 ℃孵育36 h 后收獲細(xì)胞上清采用ELISA 檢測PC10-IgG 的表達(dá)（方法同1.5）；同時(shí)加入羊抗豬IgG H&L-FITC（1:800）抗體，采用直接免疫熒光試驗(yàn)檢測腸小體中PC10-IgG 的表達(dá)。

1.9 Ad5-PC10-IgG 接種小鼠試驗(yàn)將12 只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3 組，每組4 只，其中兩組分別肌肉注射0.5 mL 1.3 中效價(jià)為1×1011pfu/mL 的Ad5-PC10-IgG 和Ad5，一組肌肉注射0.5 mL DMEM 為陰性對照。在接種后不同時(shí)間（0、1 d、3 d、5 d、7 d）采集各組小鼠血分離血清和采集肛拭子，兩種樣品經(jīng)PBS 5倍稀釋后利用1.5 的ELISA 檢測PC10-IgG 的含量；利用1.6、1.7的步驟與方法（將小鼠血清代替Ad5-PC10-IgG 接種的細(xì)胞上清）分別檢測接種后0、3 d 與7 d 小鼠血清中PC10-IgG 對PEDV 的結(jié)合活性與抑制病毒復(fù)制效果。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Graphpad prism 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的顯著性差異。*：p<0.05（差異顯著）、**：p<0.01（差異非常顯著）、***：p<0.001、****：p<0.0001（差異極顯著）、p>0.05 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ns）。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒質(zhì)粒pad5-PC10-IgG 的鑒定結(jié)果將構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pshuttlePC10-IgG 經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果顯示，獲得的目的片段大小為2.4 kb 左右，測序結(jié)果顯示片段序列與設(shè)計(jì)的序列一致。將pshut?tlePC10-IgG 質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒AdEasyTM 進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pad5-PC10-IgG。經(jīng)單酶切鑒定結(jié)果顯示片段大小為23 kb左右，且4.5 kb處有均一條帶，與預(yù)期一致，表明重組腺病毒質(zhì)粒正確構(gòu)建。 將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞10 d后出現(xiàn)CPE，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA檢測結(jié)果表明重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 正確構(gòu)建。但仍需后續(xù)鑒定重組腺病毒能否表達(dá)PC10-IgG。

2.2 Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 細(xì)胞后PC10-IgG 表達(dá)的鑒定結(jié)果將重組腺病毒感染HEK293 細(xì)胞后的培養(yǎng)上清純化后，經(jīng)SDS-PAGE 鑒定。結(jié)果顯示，純化的PC10-IgG 有兩條目的條帶，大小與純化的豬陽性血清中IgG 的重鏈與輕鏈大小一致，分別為55 ku 和25 ku 左右。Ad5 感染的細(xì)胞上清中無該目的條帶（圖1A）。western blot 鑒定結(jié)果顯示，純化的PC10-IgG 出現(xiàn)大小約55 ku 的特異性條帶，與陽性對照一致，而陰性對照無條帶（圖1B）。進(jìn)一步表明重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 正確構(gòu)建，且其感染HEK293 細(xì)胞后能夠分泌表達(dá)PC10-IgG。收獲重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 細(xì)胞后不同時(shí)間的細(xì)胞上清經(jīng)ELISA 的檢測，結(jié)果顯示，Ad5-PC10-IgG 感染細(xì)胞后在上清中能夠分泌表達(dá)PC10-IgG，感染后48 h 分泌表達(dá)的PC10-IgG 能達(dá)到10 μg/mL，并且在72 h 表達(dá)量最高，為39 μg/mL，直至108 h，PC10-IgG 的表達(dá)量還能達(dá)到35 μg/mL 左右（圖1C）。表明構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 感染HEK293細(xì)胞后能夠分泌表達(dá)高水平的PC10-IgG，并且上清中的PC10-IgG 表達(dá)量在35 μg/mL 左右能夠維持36 h之久。

圖1 Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 細(xì)胞上清中分泌表達(dá)的PC10-IgG 的SDS-PAGE（A）、western blot（B）及ELISA（C）的檢測結(jié)果Fig.1 Results of SDS-PAGE(A),westen blot(B)and ELISA(C) of PC10-IgG secreted and expressed in the supernatant of Ad5-PC10-IgG infected HEK293 cells

2.3 PC10-IgG 對PEDV 的結(jié)合試驗(yàn)檢測結(jié)果將PEDV 感染Vero E6 細(xì)胞，36 h 后經(jīng)IFA 檢測Ad5-PC10-IgG 感染的HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)上清中PC10-IgG的病毒結(jié)合活性。結(jié)果顯示，該細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PC10-IgG 和241 陽性對照血清均能與感染Vero E6 細(xì)胞的PEDV 特異性結(jié)合，呈現(xiàn)特異的綠色熒光，而Ad5 感染的細(xì)胞上清+PEDV，PEDV 對照和未感染PEDV 的細(xì)胞對照均未出現(xiàn)特異的綠色熒光（圖2）。表明Ad5-PC10-IgG 表達(dá)的PC10-IgG 能夠特異性結(jié)合PEDV。

圖2 Ad5-PC10-IgG 分泌表達(dá)的PC10-IgG 對PEDV 結(jié)合活性的檢測結(jié)果Fig.2 Results of the binding activity of the secreted PC10-IgG to PEDV

2.4 PC10-IgG 的病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果將PEDV CV777 株與Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 的細(xì)胞培養(yǎng)上清共孵育，再感染Vero E6 細(xì)胞。36 h 后經(jīng)IFA 和熒光定量PCR 分別檢測Ad5-PC10-IgG 分泌表達(dá)的PC10-IgG 的病毒抑制活性。結(jié)果顯示，與Ad5 感染的HEK293 的細(xì)胞上清+PEDV 組和PEDV 對照組感染的Vero E6 細(xì)胞相比，PC10-IgG+PEDV 感染的Vero E6 細(xì)胞特異性的紅色熒光顯著減少（圖3A），表明Ad5-PC10-IgG 分泌表達(dá)的的PC10-IgG 幾乎完全抑制了PEDV 的感染。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，Ad5-PC10-IgG 分泌表達(dá)的PC10-IgG+PEDV 共感染的Vero E6 細(xì)胞上清中的病毒載量（446.7 拷貝/100 μL）與正常Vero E6 細(xì)胞上清（497 拷貝/100 μL）、241 陽性血清對照+PEDV 共感染的Vero E6 細(xì)胞上清（498 拷貝/100 μL）基本一致均呈陰性結(jié)果；而其與Ad5 感染的HEK293的細(xì)胞上清+PEDV共感染的Vero E6細(xì)胞上清（32 509拷貝/100 μL）和PEDV感染的Vero E6細(xì)胞上清（16 939 拷貝/100 μL）差異極顯著（p<0.01）（圖3B），經(jīng)計(jì)算該組病毒載量比PEDV 對照降低了97.3%左右，該結(jié)果與IFA 結(jié)果一致。以上結(jié)果表明Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 細(xì)胞分泌表達(dá)的PC10-IgG 能夠有效抑制PEDV 感染Vero E6 細(xì)胞。

2.5 Ad5-PC10-IgG 感染豬小腸類器官模型腸小體的檢測結(jié)果將Ad5-PC10-IgG 接種豬的小腸類器官模型回腸小體，36 h 后收獲上清進(jìn)行間接ELISA 檢測，并對回腸小體進(jìn)行IFA 檢測。ELISA 結(jié)果顯示Ad5-PC10-IgG 感染腸小體后能夠在其上清中檢測到PC10-IgG 的表達(dá)（圖4A）；直接免疫熒光結(jié)果顯示，Ad5-PC10-IgG 感染的腸小體出現(xiàn)特異性綠色熒光，而Ad5 感染的腸小體與正常的腸小體則沒有熒光（圖4B）。表明重組腺病毒Ad5-PC10-IgG可以感染豬的小腸類器官模型腸小體，并且分泌表達(dá)PC10-IgG。

2.6 Ad5-PC10-IgG 感染小鼠的試驗(yàn)結(jié)果收集小鼠接種Ad5-PC10-IgG 后不同時(shí)間的血清和肛拭子經(jīng)間接ELISA 檢測。結(jié)果顯示，雖然接種Ad5-PC10-IgG 小鼠的肛拭子中沒有檢測到PC10-IgG，但在接種后第1 d（1dpi）的小鼠血清中檢測到PC10-IgG 的含量為2.78±0.5 μg/mL，第3 d（3 dpi）為2.72±0.12 μg/mL，直至第5 d（5dpi）還能檢測到0.7±0.84 μg/mL 的PC10-IgG，在接種后0 和7 d（7dpi）沒有檢測到PC10-IgG的表達(dá)；而Ad5 接種的小鼠血清和陰性對照組沒有檢測到PC10-IgG（圖5A），表明Ad5-PC10-IgG 在小鼠體內(nèi)也能表達(dá)分泌PC10-IgG。

選擇Ad5-PC10-IgG 接種0、3 dpi、7 dpi 的小鼠血清，5 倍稀釋后進(jìn)行了PEDV 的結(jié)合試驗(yàn)和病毒抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示，接種Ad5-PC10-IgG 3 dpi 的小鼠血清能與感染Vero E6 細(xì)胞的PEDV 特異性結(jié)合，呈現(xiàn)特異的綠色熒光，而接種Ad5-PC10-IgG 0、7 dpi 的小鼠血清+PEDV 以及其它對照組的細(xì)胞均未出現(xiàn)特異的綠色熒光（圖5B）。在病毒抑制試驗(yàn)中接種Ad5-PC10-IgG 3 dpi 的小鼠血清+PEDV、未感染PEDV 的細(xì)胞對照基本無特異性紅色熒光，而Ad5-PC10-IgG 0、7 dpi 和其余對照組的細(xì)胞均有大量紅色熒光（圖5C）。熒光定量PCR 結(jié)果顯示接種Ad5-PC10-IgG 3 dpi 的小鼠血清+PEDV 感染的Vero E6 細(xì)胞上清以及正常Vero E6 細(xì)胞上清中的病毒載量分別為294 拷貝/100 μL、725 拷貝/100 μL，遠(yuǎn)低于其余各組的病毒載量（≥104拷貝/100 μL）（圖5D）（p<0.05；p<0.01）。因此這兩個(gè)試驗(yàn)再次印證了上述ELISA 對小鼠血清的檢測結(jié)果，同時(shí)也表明Ad5-PC10-IgG 在小鼠體內(nèi)表達(dá)的PC10-IgG 對PEDV具有很好的結(jié)合活性與抑制病毒復(fù)制的效果。

圖5 小鼠血清中PC10-IgG 的表達(dá)（A：ELISA）、其對PEDV 結(jié)合活性（B：IFA）及病毒抑制活性（C：IFA 和D：RT-qPCR）的檢測結(jié)果Fig.5 Results of the expression of PC10-IgG in mice serum(A,ELISA);mice serum PC10-IgG-binding activity(B,IFA);mice serum PC10-IgG viral inhibitory activity(C,IFA and D,RT-qPCR)

3 討 論

PEDV 對各個(gè)年齡段的豬均能致病，尤其對仔豬的致死率接近100%，給養(yǎng)豬行業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然市場上有針對于PEDV 的疫苗，但能直接用于仔豬的PEDV 疫苗和治療制劑目前尚在研究中[13]。本研究利用Ad5 為載體來構(gòu)建表達(dá)PEDV中和抗體PC10-IgG 的重組腺病毒Ad5-PC10-IgG。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示構(gòu)建的Ad5-PC10-IgG 在感染HEK293細(xì)胞后，分泌的PC10-IgG 不僅重鏈和輕鏈與豬源IgG 一致，western blot 結(jié)果也顯示PC10-IgG 的重鏈也能被抗豬IgG FC 片段抗體所識別，表明重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 在感染HEK293 細(xì)胞后能夠表達(dá)PC10-IgG，且PC10-IgG 為完整的豬源IgG。

Ad5-PC10-IgG 感染HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)上清中表達(dá)的PC10-IgG分泌量約能達(dá)到39.975 μg/mL，并且含量在30 μg/mL 以上能維持36 h 之久，而在接種Ad5-PC10-IgG的小鼠體內(nèi)PC10-IgG的表達(dá)量最高也能達(dá)到約13.6 μg/mL，而在接種后第5 d 其表達(dá)量還能達(dá)到3.5 μg/mL。并 且 表 達(dá) 的PC10-IgG 對PEDV 具有很好的結(jié)合活性與抑制病毒復(fù)制的效果。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示PC10-IgG 對CV777 株（G1）的病毒感染半數(shù)抑制量（IC50）為0.103 μg/mL，對Lnct 2 株（G2）的IC50為5.23 μg/mL[4]，而本研究構(gòu)建的Ad5-PC10-IgG表達(dá)的PC10-IgG 量遠(yuǎn)高于上述結(jié)果，表明Ad5-PC10-IgG 分泌的該抗體含量足夠達(dá)到相應(yīng)的抗病毒效果。有研究表明Ad5 能夠感染豬的小腸并表達(dá)目的蛋白[6]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明Ad5-PC10-IgG 感染豬的小腸類器官模型也可以分泌表達(dá)PC10-IgG。而豬的小腸為PEDV 靶器官，推測Ad5-PC10-IgG 具有在豬的小腸上皮細(xì)胞抑制PEDV 感染的潛能。

在小鼠實(shí)驗(yàn)中，接種Ad5-PC10-IgG 的小鼠雖然在其肛拭子中沒有檢測到PC10-IgG，但在其血清中檢測到了該抗體：接種后第1 d 的小鼠血清中就出現(xiàn)了較高含量的PC10-IgG（13.6±0.14 μg/mL），而在接種后第5 d 還能達(dá)到3.5 μg/mL。推測可能是由于采集的拭子體積太小樣本量沒有達(dá)到檢測的臨界值。本實(shí)驗(yàn)用的是6 周齡小鼠，免疫系統(tǒng)已完善，PC10-IgG 在小鼠體內(nèi)為外源蛋白，所以無論是載體還是PC10-IgG 都會被小鼠免疫系統(tǒng)迅速清除，在這種條件下重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 接種小鼠后第5 d 還能在其血清中檢測到PC10-IgG。表明小鼠試驗(yàn)中Ad5-PC10-IgG 的接種劑量完全達(dá)到要求。之前相關(guān)研究都是利用Ad5 在機(jī)體內(nèi)表達(dá)抗原以引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。利用Ad5 在小鼠和豬體內(nèi)表達(dá)抗體之前未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用重組腺病毒Ad5-PC10-IgG 在小鼠體內(nèi)表達(dá)PC10-IgG 的接種劑量及該實(shí)驗(yàn)本身不僅為Ad5-PC10-IgG 感染豬的實(shí)驗(yàn)提供借鑒，而且對相關(guān)研究也具有參考價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的Ad5-PC10-IgG 可以在小鼠體內(nèi)和體外表達(dá)具有生物活性的PC10-IgG，表明其具備成為PEDV 治療制劑的潛力，但是PEDV 存在諸多亞型，且亞型與亞型之間存在遺傳差異，表達(dá)的PC10-IgG 對PEDV 變異株的抑制效果還有待進(jìn)一步研究[14]。另外對仔豬的接種劑量以及保護(hù)效果也值得進(jìn)一步探究。